そこでHeLa細胞、XP-C細胞それぞれよりQ1の精製を試みた。最終精製標品は双方ともSDS-PAGE上単一バンドで73KDであった。得られた標品を用いて種々の性状解析比較、即ち種々のDNA要求性、ヌクレオチド要求性、DNAヘリカーゼ活性等についての比較検討を行ったが、両者の間には大きな差異を認めることが出来なかった。以下、修復正常細胞とXP-C細胞のQ1について検討をした。HeLa細胞由来Q1より得られたcDNAの塩基配列から得られたアミノ酸配列より合成したぺプチドを抗原としてポリクローナル抗体を得、同蛋白質量のそれぞれの核抽出液に対しWestem blot解析を行ったが、両Q1蛋白量に差を認めなかった。次に得られた抗体を用いて免疫沈降を行ったが、両Q1共に他の蛋白質との複合体形成は認められなかった。更にリン酸化量の差異の検討を試みたが、Q1自体にリン酸化を認めることが出来なかった。これらの結果から修復正常細胞とXP-C細胞各由来のQ1それ自体には顕著な差異がないものと考えられた。

　次にQ1がXPCCであるか否かの判定を無細胞DNA修復系を用いて行った。この系はManleyの細胞抽出液中に加えて反応したUV照射ミニクロモソームへのデオキシヌクレオチドの取り込み量を観測するものである。XP-C細胞抽出液にQ1を添加して反応を行ったが、修復正常の細胞抽出液中に於ける取り込みのレベルに比べて低く、そのレベルはQ1無添加で反応させたものと同程度であった。また更に、XP-C細胞にQ1をマイクロインジェクションしたが、NERの指標である不定期DNA合成(unschduled DNA synthesis＝UDS)が正常なレベルにまで復さなかった。従ってQ1はXPCCではないことが確認された。また抗Q1抗体を修復正常細胞にマイクロインジェクションにより導入した処、UDSの低下は認められなかったが、無細胞DNA修復系に於て修復正常細胞抽出液に導入した処、修復活性に低下するものが認められたことよりQ1はNERと関連する可能性が示唆された。

　そこで次にXPCCの精製を無細胞DNA修復系を用いて行った。HeLa細胞核を0.3M KClで抽出後、超遠心して得られた上清をKCl濃度のステップワイズで活性をカラム溶出した。変性DNAセルロースカラム上、高塩濃度で溶出した画分を順次Mono Qカラム、CMセルロースカラムから溶出、KCl直線濃度勾配で変性DNAセルロースに展開して最終精製標品とした。標品はSDS-PAGE上分子量125KDの単一バンドであり、その挙動は活性のピークと一致、XP-C細胞抽出液に添加して反応させると量依存的に修復活性が認められた。またXP-A細胞抽出液に加えて反応させたが活性は低く、既知のXPAC(XP-A complementing factor)を加えると正常レベルにまで復した。またXP-C細胞抽出液にXPAC、当該蛋白質を加えると後者のみNER活性が回復された。ここで確かにXPCCが精製されたものと考えられた。

　ヒトNERに関与するXPCCの精製に成功した。これはヒトNER因子を蛋白質の側から同定した最初の例であり、無細胞修復系による因子の検索の有効性が示された。今後DNAの認識や蛋白質間の相互作用に関する新しい情報が得られ、ヒトNERの全容が解明されることが期待される。修復正常細胞粗抽出液とXP-C細胞粗抽出液中のQ1はmono Qカラム溶出パターン上、ずれを生じたが、Q1自体はXPCCでないものの、NERには関連性があることが示唆された。

　XP-C細胞及びHeLa細胞の核抽出液を出発材料にしてDNA依存性ATPase Q1を精製した。両細胞からの最終精製標品はともにSDS-PAGE上で73kDの単一バンドであった。この精製標品をもちいて両細胞のQ1のDNA依存性ATPase活性、DNAヘリカーゼ活性のDNA要求性、ヌクレオチド要求性、塩感受性、温度感受性等種々の性質を比較検討し、精製したQ1そのものの性状は両細胞で大きな差異がないことを明らかにした。また、C末端近傍のアミノ酸配列に対応する合成ペプチドを用いてポリクローナル抗体を作製し、この抗体を用いて粗抽出中のQ1を免疫沈降してQ1の他の蛋白質との複合体形成の違いを検討したが、両細胞で違いは認められなかった。さらに、Q1のリン酸化の差異を検討し、Q1のリン酸化には差がなくどちらの細胞でもリン酸化されていないことを明らかにした。

　Q1が真にXP-C細胞の欠損蛋白質であるかどうかを明らかにするために精製したQ1やQ1の抗体を用いて、マイクロインジェクションとcell-freeのDNA修復系で解析した。XP-C細胞にHeLa細胞から精製したQ1をマイクロインジェクションしたが、DNAの修復合成は正常レベルに戻ることはなかった。また、修復の正常な細胞に抗Q1抗体をマイクロインジェクションしても修復の低下は認められなかった。さらに、XP-C細胞の抽出液を含むcell-freeのDNA修復系にHeLa細胞から精製したQ1を添加してもDNAの修復合成の回復は観察されず、HeLa細胞の核抽出液のQ1を含まない画分を添加すると修復合成が回復したことから、Q1そのものがXP-C細胞の欠損蛋白質ではないことが示された。

　Q1以外にXP-C細胞のDNA修復の欠損を相補する因子があることが明らかになったので、XP-C細胞の抽出液を含むcell-freeのDNA修復系をもちいて修復能の回復を指標にして、HeLa細胞の核抽出液からXP-C細胞のDNA修復の欠損を相補する因子の精製を試みた。精製標品はSDS-PAGE上で125kDの単一バンドの蛋白質を含み、精製の最終カラムでのこの蛋白質の挙動と活性のピークとが一致していた。この蛋白質をXP-C細胞の抽出液を含むcell-freeのDNA修復系に添加するとその量に依存して修復能が回復し、一方、XP-A細胞の抽出液を含む修復系に添加しても修復能は回復せず、修復能が正常なHeLa細胞の抽出液を含む修復系に添加した場合には何の影響も観察されなかった。したがって精製された蛋白質はXP-C細胞の欠損を特異的に相補する蛋白質と考えられる。

　本研究はXP-C細胞でQ1が変化しているという観察に基づき、Q1のヌクレオチド除去修復への関与の可能性を検討し、その過程でXP-C細胞のDNA修復能の欠損を相補する蛋白質の精製に初めて成功したものである。これは、cell-freeのDNA修復系をもちいてヒトの細胞のヌクレオチド除去修復に関与する蛋白質が精製された最初の例である。この研究の延長でこの蛋白質をコードするcDNAが単離され、遺伝子の側からもこの蛋白質がXP-C細胞で欠損している蛋白質であることが明らかにされた。以上を要するに、本研究はヒトの細胞のヌクレオチド除去修復機構の解析に大きな進展をもたらし、癌細胞生物学の研究の進展に寄与するものであり、博士(薬学)の学位論文として十分な価値があるものと認められる。