細胞膜上には、シナプス、被覆小胞、細胞間接着部位など様々な機能ドメインが存在する。このようなドメインには、その機能を担うタンパク質が局在しているが、局在の機構は未だ明らかになっていない。このような局在の機構、及び、細胞膜の機能ドメインの形成の機構の解明に寄与することを目的として本研究をはじめた。各々の機能ドメインには当然、それぞれに特異的な形成機構が存在するが、そこには共通の原理や機構が働いていることが考えられる。このような共通の原理としてまず考えられるものは、膜タンパク質が細胞膜上を移動することによって、オリゴマー化したりすること、細胞骨格-膜骨格系と相互作用することなどである。本研究では、これらの過程と機構がどのように働くか、どのように協調して機能するかについて、いくつかの膜タンパク質について検討した。

　トランスフェリンレセプターは細胞内への鉄の取り込みを担う細胞膜貫通型タンパク質で、2量体を形成し、トランスフェリンの結合の有無に関わらず、被覆小胞に集合する。その後、細胞内に取り込まれ、再び、細胞膜上に発現するという過程をたどっている。また、カドヘリンは、カルシウム依存的にホモフィリックな結合をすることにより、細胞間接着を担うタンパク質であり、大きなファミリーを形成している。カドヘリンは細胞膜上の自由表面にも存在するが、多くは細胞間接着部位に集合し、上皮細胞ではさらにアドヒーレンス結合に多くが濃縮される。カドヘリンにはその構造より、従来より報告のある膜貫通型のもの(E-カドヘリン、N-カドヘリン等)と、最近発見された、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型のT-カドヘリンが存在する。細胞膜貫通型のカドヘリンによる細胞間接着にはカドヘリンの細胞質部分がカテニンタンパク質群と結合し、さらにこの複合体がアクチン線維と結合することが重要であると考えられてきた。しかしながら、GPIアンカー型のT-カドヘリンは細胞質領域を持たないにも関わらず、細胞間接着を引き起こすことが報告されている(Deborah J.Vestal and Barbara Ranscht,1992,J.Cell Biol.,119:451-461)。一方、最近、GPIアンカー型のタンパク質はカベオラと呼ばれる細胞膜上の陥入体(クラスリンの裏打ち構造がないため被覆小胞と区別される)に集合しており(R.G.W.Anderson,Curr.Opinion Cell Biol.,1993,R.G.W.Anderson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993)、さらにカベオラには情報伝達を担う様々な分子(Gタンパク質、チロシンキナーゼ、セリン/スレオニンキナーゼなど)が濃縮されているという報告が出されている(Sargiacomo et al.J.Cell Biol.1993)。これらのことより、T-カドヘリンもカベオラに存在する可能性、及びT-カドヘリンの細胞間接着能にカベオラへの局在が関与する可能性が示唆される。本研究では、膜領域への集合機構解明への第一歩として、これらのタンパク質の細胞膜上での運動とその制御機構を明らかにすることを目指した。方法としては、一粒子追跡法及びレーザー光ピンセット法を用い、トランスフェリンレセプター、T-カドヘリン及びN-カドヘリンの3種の膜タンパク質について研究を行なった。特にT-カドヘリンは、膜タンパク質としてはまだ研究が進んでいないGPIアンカー型タンパク質であるので、T-カドヘリンを中心に研究を進めた。

　まず、CHO-DG44細胞に遺伝子導入で強制発現させたT-カドヘリン及びN-カドヘリンをそれぞれのカドヘリンに対する抗体を介して、直径40nmの金コロイド微粒子で標識しそれらの運動をビデオエンハンス顕微鏡法により追跡した(一粒子追跡法)。この方法による運動観察の時間分解能は33ミリ秒、空間精度は1.8nmである。トランスフェリンレセプターについては抗体のかわりに、基質であるトランスフェリンに金コロイド微粒子を結合させたものを用いた。運動の制御機構を調べるためまず、3秒間という短時間の運動での運動モードの分類を行なった。T-カドヘリン、N-カドヘリン、トランスフェリンレセプターともに単純拡散運動をしているものが全体の50%以上を占めたが、T-カドヘリンについては方向性を持った運動をする粒子が特徴的であり、また、N-カドヘリン、トランスフェリンレセプターについては制限された範囲内を単純拡散運動するものが多く見られた。短時間、特定部位での挙動を比較する微視的拡散係数はT-カドヘリン、N-カドヘリン、トランスフェリンレセプターともほとんど変わらず平均1.4×10^-10cm²/s程度であった。すなわち、T-カドヘリンは脂質で膜に結合しているにもかかわらず、微視的拡散係数は膜貫通型タンパク質と同程度であった。また、トランスフェリンレセプターについては過去に報告のある、NRK細胞上、及びF7p細胞上での運動と比較し(Kusumi et al.,Biophys.J.,1993;Sako and Kusumi,J.Cell Biol.,1994)、単純拡散運動をしているものについてはF7p細胞上のものが他の2つに比べ約1/3の速さであり、一方制限された運動をしているものについては、NRK細胞上のものが他の2つより7-10倍も速い運動をしていることがわかった。これらのことより、同じタンパク質でも発現している細胞により、その運動の制御は異なることが明らかとなった。

　次に、これらのタンパク質の運動がどのような要因によって制御されているかを調べるために、集光したレーザー光によって金コロイド微粒子を捕捉し、レーザー光を掃引することで細胞膜上のタンパク質分子を強制的に動かしそのときの応答を解析した。(レーザー光ピンセット法)レーザー光ピンセット法は、細胞膜タンパク質と細胞骨格系タンパク質との相互作用を解析するのに有効な手段である。まず捕捉力を0.25pN,0.05pNの2つで、牽引速度2.2m/sでレーザー光ピンセットによりタンパク質を牽引したところ、T-カドヘリンでは捕捉力0.25pNでは150nm、0.05pNでは牽引距離は90nmであった。一方、N-カドヘリンでは強い力では570nm牽引できたが、弱い力では180nmであった。トランスフェリンレセプターはT-カドヘリンと同じような傾向を示した。次に牽引速度を0.6m/sに下げて牽引を行なった。この時は2.2m/sに比べどのタンパク質も牽引距離が伸びたが、T-カドヘリンはやはりあまり引っ張れなかった。これらの結果より、(1)T-カドヘリンは細胞外、あるいは細胞膜内で他の膜タンパク質を介することにより、間接的に、細胞骨格系タンパク質などと相互作用している可能性、あるいは、(2)トランスフェリンレセプターが被覆小胞に入っているようにカベオラに入っているためにあまり牽引できない可能性が示された。

　次に、T-カドヘリンの運動制御にカベオラが関与しているかを調べる目的で蛍光抗体染色法により、カベオラのマーカータンパク質であるカベオリンとT-カドヘリンの2重染色を行ない、細胞膜上での分布を調べたところ、両者は、細かい点状の染色を示し、一部共存していた。さらに、GPIアンカー型のタンパク質のカベオラへの局在はGPIアンカー型のタンパク質が抗体によって架橋された時(クロスリンクされた時)にのみ起こるという報告があることから(Mayor et al.,Science,1994)、この時のカベオリンとT-カドヘリンの2重染色も行なった。その結果、両者の染色は大きな点状になりその分布は良く一致していた。これらの結果より、T-カドヘリンは少なくともその一部は通常の細胞培養条件においてもカベオラに存在していることが示された。さらにT-カドヘリンの点状の染色はアクチン線維と共存していることが多いことも示された。また、カベオラ自体がアクチン線維と結合しているという報告もある(Izumi et al.,Anat.Rec.,1988;J.Electron Microsc.,1989;J.Electron Microsc.Tech.,1991;Kurzchalia et al.,J.Cell Biol.,1992)。一粒子追跡法及びレーザー光ピンセット法により、クロスリンクしたT-カドヘリン及びN-カドヘリンの運動を調べた結果は、どちらも少し拡散係数が小さくなり牽引距離も短くなった。N-カドヘリンはアクチン線維と相互作用することがわかっており、T-カドヘリンがN-カドヘリンと似たような運動傾向を示すことは、T-カドヘリンもアクチン線維と結合している可能性を示す。

　以上の結果より、T-カドヘリンは脂質を介して膜に結合しているにもかかわらず、運動には大きな制限が働いていること、その制限は、カベオラを介して、あるいは他の膜貫通型タンパク質との相互作用を介してアクチン線維に結合することにより行なわれている可能性が示された。これは、細胞膜上でのタンパク質の運動、集合、局在を考える上で、細胞膜タンパク質とアクチン線維との相互作用が重要であることを示すものであり、他のタンパク質の局在化の機構についても示唆を与えるものである。

　本論文は、細胞膜上の様々な機能ドメインに局在するタンパク質の局在の機構、及び、細胞膜の機能ドメインの形成の機構についての研究である。このようなタンパク質の局在は細胞膜機能を発現するために必須の現象であるが、そこに働く原理については、ほとんど研究がすすんでおらず、その意味においても本論文は重要な知見を与えるものである。細胞膜上の各々の機能ドメインには当然、それぞれに特異的な形成機構が存在するが、そこには共通の原理や機構が働いていることが考えられる。このような共通の原理としてまず考えられるものは、膜タンパク質が細胞膜上を移動することによって、オリゴマー化したりすること、細胞骨格-膜骨格系と相互作用することなどである。本論文では、これらの過程と機構がどのように働くか、どのように協調して機能するかについて、いくつかの膜タンパク質について検討している。

　本論文の構成は2章よりなり、第一章で扱われているトランスフェリンレセプターは、細胞内への鉄の取り込みを担う細胞膜貫通型タンパク質で、2量体を形成し、トランスフェリンの結合の有無に関わらず、被覆小胞に集合しその後、細胞内に取り込まれ、再び、細胞膜上に発現するという過程をたどっている。また、第2章で扱われているカドヘリンは、カルシウム依存的にホモフィリックな結合をすることにより、細胞間接着を担うタンパク質であり、大きなファミリーを形成している。カドヘリンは細胞膜上の自由表面にも存在するが、多くは細胞間接着部位に集合し、上皮細胞ではさらにアドヒーレンス結合に多くが濃縮される。カドヘリンにはその構造より、従来より報告のある膜貫通型のもの(E-カドヘリン、N-カドヘリン等)と、最近発見された、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型のT-カドヘリンが存在する。細胞膜貫通型のカドヘリンによる細胞間接着にはカドヘリンの細胞質部分がカテニンタンパク質群と結合し、さらにこの複合体がアクチン線維と結合することが重要であると考えられてきた。しかしながら、GPIアンカー型のT-カドヘリンは細胞質領域を持たないにも関わらず、細胞間接着を引き起こすことが報告されている(Deborah J.Vestal and Barbara Ranscht,1992,J.Cell Biol.,119:451-461)。一方、最近、GPIアンカー型のタンパク質はカベオラと呼ばれる細胞膜上の陥入体(クラスリンの裏打ち構造がないため被覆小胞と区別される)に集合しており(R.G.W.Anderson,Curr.Opinion Cell Biol.,1993,R.G.W.Anderson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993)、さらにカベオラには情報伝達を担う様々な分子(Gタンパク質、チロシンキナーゼ、セリン/スレオニンキナーゼなど)が濃縮されているという報告が出されている(Sargiacomo et al.J.Cell Biol.1993)。これらのことより、T-カドヘリンもカベオラに存在する可能性、及びT-カドヘリンの細胞間接着能にカベオラへの局在が関与する可能性が示唆される。

　本論文では、膜領域への集合機構解明への第一歩として、これらのタンパク質の細胞膜上での運動とその制御機構を明らかにすることを目的としている。方法としては、一粒子追跡法及びレーザー光ピンセット法を用い、トランスフェリンレセプター、T-カドヘリン及びN-カドヘリンの3種の膜タンパク質について研究を行なっており、特にT-カドヘリンは、膜タンパク質としてはまだ研究が進んでいないGPIアンカー型タンパク質であるので、T-カドヘリンを中心に研究が進められている。

　研究の具体的方法は、まず、CHO-DG44細胞に遺伝子導入で強制発現させたT-カドヘリン及びN-カドヘリンをそれぞれのカドヘリンに対する抗体を介して、直径40nmの金コロイド微粒子で標識しそれらの運動をビデオエンハンス顕微鏡法により追跡している(一粒子追跡法)。この方法による運動観察の時間分解能は33ミリ秒、空間精度は1.8nmである。トランスフェリンレセプターについては抗体のかわりに、基質であるトランスフェリンに金コロイド微粒子を結合させたものを用いている。運動の制御機構を調べるためまず、3秒間という短時間の運動での運動モードの分類を行なった。T-カドヘリン、N-カドヘリン、トランスフェリンレセプターともに単純拡散運動をしているものが全体の50%以上を占めたが、T-カドヘリンについては方向性を持った運動をする粒子が特徴的であり、また、N-カドヘリン、トランスフェリンレセプターについては制限された範囲内を単純拡散運動するものが多く見られた。短時間、特定部位での挙動を比較する微視的拡散係数はT-カドヘリン、N-カドヘリン、トランスフェリンレセプターともほとんど変わらず平均1.4×10^-10cm²/s程度であった。すなわち、T-カドヘリンは脂質で膜に結合しているにもかかわらず、微視的拡散係数は膜貫通型タンパク質と同程度であった。また、トランスフェリンレセプターについては過去に報告のある、NRK細胞上、及びF7p細胞上での運動と比較し(Kusumi et al.,Biophys.J.,1993;Sako and Kusumi,J.Cell Biol.,1994)、単純拡散運動をしているものについてはF7p細胞上のものが他の2つに比べ約1/3の速さであり、一方制限された運動をしているものについては、NRK細胞上のものが他の2つより7-10倍も速い運動をしていることがわかった。これらのことより、同じタンパク質でも発現している細胞により、その運動の制御は異なることが明らかとなった。

　次に、これらのタンパク質の運動がどのような要因によって制御されているかを調べるために、集光したレーザー光によって金コロイド微粒子を捕捉し、レーザー光を掃引することで細胞膜上のタンパク質分子を強制的に動かしそのときの応答を解析している。(レーザー光ピンセット法)レーザー光ピンセット法は、細胞膜タンパク質と細胞骨格系タンパク質との相互作用を解析するのに有効な手段である。まず捕捉力を0.25pN,0.05pNの2つで、牽引速度2.2m/sでレーザー光ピンセットによりタンパク質を牽引したところ、T-カドヘリンでは捕捉力0.25pNでは150nm、0.05pNでは牽引距離は90nmであった。一方、N-カドヘリンでは強い力では570nm牽引できたが、弱い力では180nmであった。トランスフェリンレセプターはT-カドヘリンと同じような傾向を示した。また牽引速度を0.6m/sに下げて牽引を行なったときは、2.2m/sに比べどのタンパク質も牽引距離が伸びたが、T-カドヘリンはやはりあまり引っ張れなかった。これらの結果より、(1)T-カドヘリンは細胞外、あるいは細胞膜内で他の膜タンパク質を介することにより、間接的に、細胞骨格系タンパク質などと相互作用している可能性、あるいは、(2)トランスフェリンレセプターが被覆小胞に入っているようにカベオラに入っているためにあまり牽引できない可能性が示されている。

　次に、T-カドヘリンの運動制御にカベオラが関与しているかを調べる目的で蛍光抗体染色法により、カベオラのマーカータンパク質であるカベオリンとT-カドヘリンの2重染色を行ない、細胞膜上での分布を調べたところ、両者は、細かい点状の染色を示し、一部共存していた。さらに、GPIアンカー型のタンパク質のカベオラへの局在はGPIアンカー型のタンパク質が抗体によって架橋された時(クロスリンクされた時)にのみ起こるという報告があることから(Mayor et al.,Science,1994)、この時のカベオリンとT-カドヘリンの2重染色も行なった。その結果、両者の染色は大きな点状になりその分布は良く一致していた。これらの結果より、T-カドヘリンは少なくともその一部は通常の細胞培養条件においてもカベオラに存在していることが示された。さらにT-カドヘリンの点状の染色はアクチン線維と共存していることが多いことも示された。また、カベオラ自体がアクチン線維と結合しているという報告もある(Izumi et al.,Anat.Rec.,1988;J.Electron Microsc.,1989;J.Electron Microsc.Tech.,1991;Kurzchalia et al.,J.Cell Biol.,1992)。一粒子追跡法及びレーザー光ピンセット法により、クロスリンクしたT-カドヘリン及びN-カドヘリンの運動を調べた結果は、どちらも少し拡散係数が小さくなり牽引距離も短くなった。N-カドヘリンはアクチン線維と相互作用することがわかっており、T-カドヘリンがN-カドヘリンと似たような運動傾向を示すことは、T-カドヘリンもアクチン線維と結合している可能性を示す。

　以上の結果より、T-カドヘリンは脂質を介して膜に結合しているにもかかわらず、運動には大きな制限が働いていること、その制限は、カベオラを介して、あるいは他の膜貫通型タンパク質との相互作用を介してアクチン線維に結合することにより行なわれている可能性が示された。これらの結果は、細胞膜上でのタンパク質の運動、集合、局在を考える上で、細胞膜タンパク質とアクチン線維との相互作用が重要であることを示すものであり、他のタンパク質の局在化の機構についても示唆を与えるものである。

　このように本論文は、細胞膜上でのタンパク質の運動を調べることで、膜タンパク質の局在化の機構及び、機能的膜ドメインの形成機構について一つの仮説を与え、特に、これまでほとんど研究が進んでいなかった、GPIアンカー型タンパク質の運動について、多くの知見を与えた点で、今後の研究の発展に寄与するものであり、本論文が博士(理学)の学位に値するという点については、審査委員会の全委員が意見の一致を見た。