カワカマス・パルブアルブミン(pI＝4.10)のMg²⁺結合型、Mn²⁺結合型、Ca²⁺結合型の(重)水溶液中での赤外吸収スペクトルを測定すると、それぞれバンド幅の広い同じようなスペクトルパターンを与えるので、それらから有用な情報を抽出することは難しい。そこで、それぞれのスペクトルに二次微分演算及びフーリエ・セルフ・デコンボルーション(以下「バンド分解スペクトル」と略す)を施した。COO^-逆対称伸縮振動領域において、Mg²⁺結合型では1584cm^-1に1本のバンド、Mn²⁺結合型では1584,1577cm^-1に2本のバンド、Ca²⁺結合型では1582,1553cm^-1に2本のバンドが現れ、スペクトルに違いが見いだされた。

　Ca²⁺結合型のパルブアルブミンの結晶構造解析はコイ(pI＝4.25)等いくつかの生物種で報告されたが、Mn²⁺、Mg²⁺が結合した結晶構造が報告されたのはカワカマス(pI＝4.10)だけである。X線結晶構造解析によると、この分子はCa²⁺結合部位を2個(CDサイト、EFサイト)持ち、結合部位はアミノ酸12残基からなる。配位子はCDサイトではAsp-51(1),Asp-53(3),Ser-55(側鎖のO)(5),Phe-57(主鎖のO)(7),Glu-59(9),Glu-62(12)、EFサイトではAsp-90(1),Asp-92(3),Asp-94(5),Lys-96(主鎖のO)(7),Glu-101(12),water-128である。12位のGlu-62,Glu-101側鎖COO^-基は二座配位型でCa²⁺に結合し、それ以外の側鎖COO^-基は一座配位型でCa²⁺に結合している。Mn²⁺結合型と、CDサイトにCa²⁺が結合したものの結晶構造では、12位のGlu側鎖COO^-基がMn²⁺あるいはMg²⁺に対して一座配位型(あるいはpseudo-bridging型)で結合している。従って、スペクトルの違いは、結晶構造における金属-COO^-基相互作用の違いを反映すると考えられる。

　COO^-逆対称伸縮振動領域の解釈を行うためには、モデル化合物として酢酸塩との比較を行った。酢酸塩に関するCOO^-逆対称伸縮振動とCOO^-基-二価金属イオンの結合様式との相関は、経験的に次のようにまとめられる。(1)二座配位型は、フリー型のCOO^-基のバンド(1578cm^-1)に比べて低波数側にバンドを示す。(2)一座配位型はフリー型COO^-のバンドより高波数側に現れる。(3)pseudo-bridging型(金属との結合に関係しない酸素原子に水などが水素結合した一座配位型)は、通常の一座配位型に比べて低波数側にバンドが現れる。

　パルブアルブミンの結晶構造と酢酸塩についての経験則を用いると、赤外スペクトルの結果は次のように解釈される。(1)Ca²⁺結合型で観測される1553cm^-1のバノドは、Glu-62及びGlu-101側鎖の二座配位型COO^-基に帰属される。(2)Mn²⁺結合状態では、1553cm^-1にはバンドは観測されず、その代わりに1574cm^-1にバンドが現れたので、このバンドがGlu-62,Glu-101によるものであり、一座配位型(あるいはpseudo-bridging型)を反映する。(3)Mg²⁺結合型でも1553cm^-1のバンドは観測されないので、Glu-101側鎖COO^-基は上で述べたとおりで一座配位型(あるいはpseudo-bridging型)であり、Glu-62側鎖COO^-1基も二座配位型ではMg²⁺と結合しない。

　COO^-基と金属イオンとの結合様式とCOO^-伸縮振動との相関を理解するために、モデル系としての酢酸イオンについて非経験的分子軌道計算を併用した振動解析を行った。いくつかのレベルで計算を行ったところ、HF/6-31+G^**レベルで、溶媒効果を考慮に入れたself-consistent reaction field法を適用することが有効であることが明らかになった。Ca²⁺が二座配位型で結合すると二つのC-Oの結合距離はほぼ等しくCOO^-基の対称性が保たれるが、一座配位型で結合するとC-O結合距離に差が生じ対称性が崩れる。また、二座配位型のCOO^-基はフリー型に比べて∠OCOが狭くなっている。それぞれのCOO^-逆対称伸縮振動は、二座配位型はフリー型に比べて低波数側に、一座配位型はフリー型に比べて高波数側に現れる。また、COO^-対称伸縮振動は、二座配位型はフリー型に比べて高波数側に、一座配位型はフリー型に比べて低波数側に現れる。pseudo-bridging型は一座配位型に比べて対称性が崩れず、COO^-逆対称伸縮振動はフリー型の近傍に現れることがわかった。これらの計算結果は、COO^-逆対称、対称伸縮振動バンドの波数値が、二つのC-Oの結合距離の差と∠OCOとの間に相関があることを示した。従って、(I)で述べた酢酸イオンとCa²⁺との相互作用に関する経験則を再現し、パルブアルブミンのCOO^-逆対称伸縮振動領域の解釈を支持した。

　コイ(pI＝4.25)パルブアルブミンについて、 Ca²⁺結合型、Mn²⁺結合型、Mg²⁺結合型の赤外吸収スペクトルを測定し、バンド分解スペクトルを調べると、カワカマスとほぼ同じスペクトルパターンを与えた。コイ(pI＝4.25)パルブアルブミンのGlu-62,Glu-101はCa²⁺と二座配位型で結合することが結晶構造で報告されているので、Ca²⁺結合型で観測される1553cm^-1のバンドをGlu-62及びGlu-101側鎖の二座配位型COO^-基に帰属したことの妥当性を確認した。Sr²⁺結合型,Cd²⁺結合型,Yb³⁺結合型,Tb³⁺結合型についても、同様にバンド分解スペクトルを調べた。アミドI’及び逆対称伸縮振動領域に関して、Sr²⁺結合型、Cd²⁺結合型はCa²⁺結合型に似ているが、Yb³⁺結合型、Tb³⁺結合型では、アミドI’バンドの最大ピークの位量と1553cm^-1のバンドが観測されない点で違いが見られ、ランタノイドイオンの効果がCa²⁺とは異なる可能性が示された。

　M²⁺(＝Mg²⁺,Ca²⁺,Sr²⁺,Cd²⁺)結合型及びフリー型のカルモジュリンの重水溶液中での赤外スペクトルを測定し、バンド分解スペクトルを調べた。Ca²⁺結合型とフリー型のスペクトルを比較すると、アミドI’領域の1660cm^-1のバンド、COO^-逆対称伸縮振動領域の1552cm^-1のバンド、COO^-対称伸縮振動領域の1425cm^-1のバンドが、フリー型では現れず、Ca²⁺結合型でのみ観測されることがわかった。そこで1660,1552,1425cm^-1のバンドに着目し、それぞれCa²⁺結合型(活性型)のマーカーバンドI,II,IIIとした。マーカーバンドIIは(I)で述べた1553cm^-1のバンドに対応し、4つのCa²⁺結合部位の12位のGlu側鎖COO^-基の二座配位型を反映していると考えられる。Sr²⁺結合型、Cd²⁺結合型のスペクトルはCa²⁺結合型に似ているが、Mg²⁺結合型はフリー型に似ている。すなわち、マーカーバンドIはSr²⁺結合型、Cd²⁺結型では1661,1663cm^-1に現れるが、Mg²⁺結合型では現れない。マーカーバンドIIは、Sr²⁺結合型、Cd²⁺結型では1550,1552cm^-1に現れたが、Mg²⁺結合型では観測されない。マーカーバンドIIIはすべての金属結合型で現れた。

　金属イオンと金属結合型の活性との相関はホスホジエステラーゼ活性測定等で報告され、Ca²⁺の代替イオンとしての効果は、Ca²⁺のイオン半径から離れるほど小さくなる。マーカーバンドI,IIはその傾向を定性的に示しており、金属結合による活性化と関連していることが示唆された。本研究で、Ca²⁺とMg²⁺のイオン半径の違いが12位のGlu側鎖のCOO^-基との相互作用の仕方に反映されることが明らかになった。さらに代替イオンとしての効果が高いと考えられるSr²⁺,Cd²⁺でも、これらの結合型のCOO^-逆対称伸縮振動領域のスペクトルに違いがあり、リガンドとの相互作用がCa²⁺の場合と異なる可能性が示された。

　カルモジュリンのCa²⁺結合に伴う構造変化を直接調べるため、紫外光照射により解離定数が40倍になるCa²⁺キレート剤Nitr-5共存下で、光照射によりCa²⁺濃度を変化させたときのタンパク質のスペクトル変化を差スペクトル法を用いて調べた。タンパク質とCa²⁺とが実際に結合することを、二座配位型のマーカーとなる1550cm^-1付近のバンド強度が増加することにより確認した。Ca²⁺フリー型からCa²⁺が結合するときのカルモジュリンのアミドIバンドの変化が観測され、この方法がCa²⁺との結合によるタンパク質分子の構造変化をとらえる有効な手段となりうることが示された。