タラノキ属(Aralia)はウコギ科に属する植物で、全世界約35種のうち、中国には木本約20種、草本約10種があり、日本には木本と草本2種ずつがある。中国、日本、ロシアにおいて、これらのうちいくつかが糖尿病、胃潰瘍、関節炎などの治療や強壮の目的で用いられている。木本植物における主な活性成分はトリテルペン配糖体(サポニン)と考えられるものの、単離は困難で、これらの成分の活性に関する報告はわずかである。一般に、サポニンは界面活性を有し、抗菌性、溶血性など様々な生理活性を持つことが知られており、その生理活性発現機構は両親媒性物質であるサポニンが細胞膜を撹乱するためと考えられる。本研究は中国産タラノキ属の活性成分を単離、構造決定するとともに、それらの構造と活性についての知見を得る目的で、一連のサポニンを単離し、生体膜のモデル系としてリポソームを用いて、これらサポニンの構造活性相関について検討を行った。

　卵黄レシチン(egg PC)より、蛍光剤カルセインを内封した一枚膜リポソーム(SUV)を超音波法により調製した。また、コレステロールを添加したリポソームも同様に調製した。検体による膜透過性の増大作用を、蛍光剤の漏出を指標として測定し、定量的に評価した。研究対象とした5種の粗抽出物はいずれもこの作用を示すことが観察された。さらに、そのサポニン含有画分のみが膜との作用を有することを明らかにした(表1)。

Table.1.50% Effective Concentrations (EC₅₀, mg/ml) for MeOH Extracts of Aralia Species in Calcein Leakage from SUVs

　中国で採集した野生種2種の乾燥根皮をメタノールにてそれぞれ抽出した。得られたエキスをDIAION HP-20カラムに付し、H₂O、MeOH(50〜100%)で順次溶出した。配糖体画分につきSiO₂カラムクロマトグラフィーを繰り返した後、逆相HPLCにて精製を行い、A.armataより17種、A.dasyphyllaより6種のオレアナン型トリテルペン配糖体を単離した。それらの構造を、MS、NMRスペクトルの相互比較及び加水分解の結果より解明した(図1、S1〜S9、S12〜S19)。そのうち、S1、S6、S7、S8及びS16は新規化合物であった。

Fig.1.Structures of Saponins from Aralia Speciesa:A.armata;b:A.dasyphylla;c:A.elata

　上記の内13種類及び別途入手した2種類(S10、S11)のトリテルペンサポニンについて[2]と同様に活性測定を行った(図2)。その結果、オレアノール酸の3位に結合したグルクロン酸がエステル化された化合物、または28位に糖鎖がエステル結合した化合物が、リポソーム中でのコレステロール含有、非含有にかかわらず膜透過性の増大作用を示すことが明らかとなった。

Fig.2. Dose-response Curves for Saponin-induced Calcein Leakage from Egg PC Liposomes at the Lipid Concentration of 6.4 MThe leakage is expressed as the percent leakage at 2 min

　さらに、その活性発現機構を調べるため、それぞれの脂質二重膜への結合能力および結合した際の膜攪乱能力を、結合等温線の作成により分離して検討した(図3、図4)。

図表Fig.3. Relationships between the Leakage Extents and Concentrations of Bound Saponins in Liposomes / Fig.4. Binding Isotherms of Saponins S2,S5 and S9 to egg PC SUVs;S12 to egg PC/cholesterol SUVs

　これらの15種のサポニンは、構造上の特徴とその膜透過性の増大作用の違いにより以下の四つのタイプに分類することができた(図5)。

Fig.5.Comparison of Disrupting Effects of Aralosides on Liposome^*Cholesterol-containing SUVs (egg PC/cholesterol＝4:1);r₅₀:r at 50% leakage of calcein; K₅₀:r₅₀ devided by unbound saponin

　I型-オレアノール酸28位の糖鎖と3位のグルクロン酸がエステル化された構造を有しており、膜透過性の増大作用 (EC₅₀に相当)は強く、濃度依存性も高い。

　II型-28位のcarboxyl基が遊離であり、膜親和性(K₅₀に相当)が大きく増加する一方、膜攪乱能力(1/r₅₀に相当)が著しく減少した結果、I型より膜透過性の増大作用が弱い。なお、作用の濃度依存性が低いことから、I型と異なる膜作用機構があると考えられる。

　III型-I型とほぼ同程度の膜親和性を示し、同様に強い濃度依存性があるが、膜撹乱能力はI型に比べてはるかに弱い。さらに、3位の糖鎖が長くなった場合、活性が顕著に減少することを認めた。よって、3位に結合したグルクロン酸の膜中への結合状態がサポニンの膜透過性の増大作用を大きく左右すると推定される。

　IV型-リン脂質だけで調製したリポソームには作用しないが、コレステロールを含むリポソームには膜透過性の増大作用が観測された。また、コレステロール含有量の増加とともにこの作用は強くなる。これはコレステロールとの相互作用がIV型の活性発現に重要であることを裏付けるものである。

　類似した構造を有するAralosidesの間で生体膜透過性の増大作用におけるターゲット分子と活性発現機構が違うことは興味深い。これらの膜作用は化合物の薬埋実験による生理活性の結果とも関連があると思われることから、トリテルペンサポニンを含む生薬の生理活性発現機構の解明に貢献できる。