分裂酵母はh+型とh-型の二つの接合型を持つ真核単細胞生物で、通常は1倍体細胞の体細胞分裂によって増殖する。培地の栄養源が枯渇すると接合型の異なる二つの細胞が接合し、減数分裂過程を開始する。接合に先立って、それぞれの細胞はP-factorおよびM-factorと呼ばれる接合因子を分泌する。この接合因子シグナルは1倍体細胞の接合に必要であると同時に2倍体細胞の減数分裂・胞子形成にも必要である。 このシグナル伝達経路に変異が起きると接合不能や減数分裂・胞子形成不能の表現型を示すと考えられる。これまでに報告されている接合不能変異株は、接合および減数分裂・胞子形成不能のものと、減数分裂・胞子形成はほぼ正常に行うが、接合することはできないものに分けることができる。このことに対して「接合するためには強い接合因子シグナルが必要であるが、減数分裂・胞子形成は弱い接合因子シグナルでも誘導される。従って接合はできなくても減数分裂・胞子形成が可能な変異株が存在する」という解釈が成り立つため、これまで接合という事象と減数分裂・胞子形成という事象は、"接合因子シグナルが伝達された結果"という観点ではまとめて扱われる傾向にあった。しかし、「減数分裂・胞子形成に必要なシグナルとは質的に異なる接合因子シグナルが接合にはさらに必要であり、両方が揃って初めて接合可能となる」という解釈も可能である。この可能性を検討するために、野生型接合因子受容体の遺伝子の単離を基盤に、減数分裂・胞子形成に必要な接合因子シグナルは伝達することができるが、接合に必要なシグナル伝達を優性に阻害する変異型接合因子受容体遺伝子の単離を試みた。結果は2章に分けて示した。 第一章では、接合因子シグナルの受容機構を明らかにすることを目的として、h+型細胞特異的接合不能変異の表現型を示すmap3変異株を解析した。この株はP-factorは正常に分泌するがM-factorに対する感受性を失っており、M-factor受容系に欠損がおきていると考えられた。map3遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定したところ、予想される遺伝子産物は7回の膜貫通部分を持ち、出芽酵母のa-factor受容体であるSTE3遺伝子産物と相同性を有した。また、map3遺伝子を破壊するとh+型細胞特異的接合不能の表現型を示し、M-factor依存的に転写誘導されるmat1-Pi遺伝子の転写が起きなくなった。これらの結果からmap3遺伝子がM-factor受容体の構造遺伝子であると結論した。 本来はh+型細胞に特異的に発現し、h-型細胞によって分泌されたM-factorを受容する機能を果たしているMap3を、人為的にh-型細胞で発現させたところ、栄養源が枯渇した条件下で、あたかも自分自身が分泌した接合因子に応答したかのような、方向性を持たない接合管様の細胞変形が起こった。この結果は、接合因子シグナル伝達経路がh+型細胞とh-型細胞に共通であることを示唆している。 つぎにmap3遺伝子に変異を導入することによって、h90野生型1倍体細胞の接合を多コピーで優性に阻害するクローンを2つ(map3-dn6、map3-dn9)得た。これらのクローンは、P-およびM-factorの受容体を欠いて胞子形成不能となった2倍体細胞の胞子形成能を回復させることができ、2倍体細胞の胞子形成に必要なシグナルは伝達している。また、これらのクローンの高発現によって接合不能となった1倍体細胞では、接合因子シグナル依存的に転写されるmat1-Pi遺伝子が野生型株と同程度、もしくはそれ以上に転写されていた。 接合因子受容体が受け取った接合因子シグナルは、gpa1遺伝子にコードされるGタンパク質の サブユニットを通じて細胞内に伝達され、さらに、がん遺伝子rasの分裂酵母における唯一のホモログであるras1の遺伝子産物によって調節を受けることがこれまでに明らかになっている。今回得られた変異型受容体の性質から、受容体がGpa1とRas1の両方にシグナルを伝達している可能性が考えられたため、この可能性を検討すると共に、Map3-dn9タンパク質の下流に位置する因子の同定を試みた。 強い転写活性を持つADHプロモーターの制御下においたmap3-dn9をh90野生型一倍体細胞の染色体中に組み込んだところ、細胞は接合不能となった。この株でras1遺伝子を高発現させると接合能が回復した。しかし、野生型あるいは活性化型のgpa1遺伝子では回復しなかった。すなわち、Map3は接合に必要なシグナルをRas1を介して細胞内へ伝達しているが、Map3-dn9はこれを阻害することによって接合不能を引き起こしている可能性が考えられた。 野生型Map3の標的がGpa1のみでないことをさらに確かめるために、h90map3遺伝子破壊株において、野生型あるいは活性化型のgpa1遺伝子を高発現させ、map3遺伝子破壊株の接合不能の表現型が抑圧されるか観察した。その結果、野生型あるいは活性化型のgpa1遺伝子は0.001%以下というmap3遺伝子破壊株の接合率を0.01%程度まで上昇させたが、Map3の機能を代替するほどの抑圧能は示さなかった。これに対して、野生型のras1遺伝子を高発現させると、map3遺伝子破壊株の接合率は0.1%にまで上昇した。以上の結果から、Map3の標的はGpa1のみではないこと、また、1倍体細胞の接合に必要な接合因子シグナルの伝達にはRas1が寄与していることが示唆された。 第2章では、接合に必要な接合因子シグナル伝達経路上に位置する因子を同定することを目的として、上述のmap3-dn9高発現株を多コピーで抑圧するクローンを検索した。分裂酵母の栄養源飢餓条件下でのcDNAライブラリーによってmap3-dn9高発現株を形質転換し、約130,000個の形質転換体について接合能の回復を調べたところ、回復させるクローンが5つ得られた。このうち3つはras1遺伝子であることをサザン解析によって確認した。残る2つのクローンは異なる遺伝子をコードしており、遺伝子産物の特徴から、ubp1(homologue of ubiquitin-specific processing protease)およびgep1(homologue of guanine-nucleotide exchanging protein)と命名し解析を進めた。 ubp1遺伝子を多コピーで発現させると接合率は40%程度まで回復し、野生型細胞の接合子と同様の形態の接合子が形成された。しかし、野生型のmap3遺伝子を欠くmap3-dn9高発現株の場合は接合率は10%程度にしか回復しなかった。ubp1のcDNA全長について塩基配列を決定したところ、この遺伝子は875アミノ酸からなるORFをコードしており、予想されるアミノ酸配列はユビキチンC末端加水分解酵素(脱ユビキチン酵素)に特徴的な配列であるシステイン領域およびヒスチジン領域を含んでいた。ユビキチンC末端加水分解酵素としてこれまでに出芽酵母ではUBP1〜4およびYUH1が同定されている。今回単離された分裂酵母ubp1遺伝子産物はシステインおよびヒスチジン領域以外の部分においては、出芽酵母Ubp4、原がん遺伝子として単離されているマウスubp遺伝子産物、ヒトのがん遺伝子tre-2遺伝子産物と比較的高い相同性を示した。ubp1遺伝子破壊株は野生型株と同様に接合・胞子形成し、明らかな表現型は示さなかった。 ユビキチンC末増加水分解酵素はユビキチンのC末端のGly残基と、ユビキチンと結合しているタンパク質のLysの -アミノ基をATP非依存的に切断する酵素である。この酵素の機能として、(1)ユビキチン前駆体から成熟したユビキチンへのプロセシング、(2)複数のユビキチンがタンパク質に結合しているとき、このユビキチンを切り離し、タンパク質を分解から守るという機能、(3)ユビキチン経路で分解されてペプチドとなったタンパク質とユビキチンの最終的な複合体を切断する機能、の3つの可能性が考えられている。今回得られた分裂酵母ubp1は、野生型Map3が残っている場合により強くmap3-dn9高発現株を抑圧した。このことから、Map3を安定化することにより野生型Map3由来のシグナルを増強する可能性、あるいはMap3-dn9を消化させ、野生型Map3からのシグナルを阻害なしに伝達させる可能性など、より受容体に近接した位置で働いている可能性が考えられる。 gep1遺伝子を多コピーで発現させると接合率は5%程度に回復した。このとき細胞は丸くなり、接合子も丸い細胞が二つ連結したような形態を示した。gep1による接合能の抑圧は、ubp1の場合と異なり、野生型map3遺伝子の有無による大きな影響を受けなかった。gep1遺伝子の高発現によって細胞が丸くなる現象は野生型細胞においても観察された。gep1のcDNAクローンの全塩基配列を決定したところ、520アミノ酸からなるORFを含んでおり、予想される遺伝子産物はVav、Dbl、出芽酵母のCdc24といった、rhoタンパク質のグアニンクレオチド交換因子と、そのコンセンサス領域で相同性を示した。gep1遺伝子破壊株はそれ自身では明らかな表現型は示さなかったが、gep1遺伝子とral1/scd1遺伝子の2重遺伝子破壊株は致死の表現型を示した。 ral1/scd1遺伝子産物は分裂酵母における出芽酵母のCdc24ホモログと考えられている。その遺伝子破壊株は接合不能で、丸い細胞形態を示す。また、ral1/scd1遺伝子を高発現すると、gep1の場合同様、細胞は丸い形態を示す。出芽酵母のCdc24は、rhoファミリーに属しているCdc42のグアニンクレオチド交換因子活性を持っていることが示されており、細胞極性の決定に関わっていると考えられている。分裂酵母でも出芽酵母のCdc42ホモログであるCdc42spが同定され、これに活性化型変異を導入すると細胞が丸くなるため、Ral1/Scd1で制御されるrhoの可能性がある。しかし、cdc42spの遺伝子破壊株は致死となり、ral1/scd1遺伝子破壊株の表現型とは異なっている。gep1遺伝子とral1/scd1遺伝子の2重遺伝子破壊株が致死となることから、Gep1とRal1/Scd1の両者がCdc42spのグアニンンクレオチド交換因子として機能している可能性が新たに示唆された。 今回の解析から、7回膜貫通型の受容体であるMap3が、Gpa1を経由する接合因子シグナルに加え、それとは質的に異なる、1倍体細胞の接合に必要な接合因子シグナルをRas1を介して細胞内に伝達していることが明らかになった。さらに、後者の経路では、Ras1の調節因子や、rhoタンパク質などが機能している可能性が示唆された。今後、この経路の詳細を明らかにすることで、rasをめぐる新たなカスケードが見い出されるかも知れない。Map3-dn9高発現株の多コピー抑圧遺伝子をさらに検索することなどによって解析を発展させたい。 |