ユウレイボヤ精子は海水に懸濁してもほとんど運動性を示さない。しかし周囲に卵が存在すると、精子は着しく活性化され卵へと誘引される。これは、精子活性化物質及び精子誘引物質が卵から周囲の海水中に放出されるためであると考えられる。そこでまずこれらの由来について検討した。ホヤの卵は卵細胞、及び付属器官であるテスト細胞、卵黄膜、濾胞細胞からなっているが、これまでは精子誘引物質の放出部位は濾胞細胞であると考えられてきた。そこで、ユウレイボヤの卵を付属器官とそれらを除いた卵細胞に分離し、各々の成分の精子誘引活性を精子運動解析装置CellSoftを用いて調べた。すると精子活性化および精子誘引活性を示したのは卵細胞のみで、精子誘引源と考えられていた濾胞細胞や、卵黄膜、テスト細胞はこの活性を示さなかった。この結果は、精子誘引物質の放出部位は卵細胞自身であることを示している。また、多くの精子は卵細胞の植物極側に誘引された。これは卵細胞における精子誘引物質の放出部位は植物極側であることを示唆している。

　これまでの精子走化性の定量法は、誘引源近くの精子密度、精子鞭毛打の角度、精子の描く軌跡の半径などの変化を測定し行なわれてきたが、いずれも走化性を直接的に定量化するものではないため決め手にかけていた。そこで私はこの精子走化性を定量化する方法として新たな方法を開発した。卵を中心とした極座標上においては、精子の位置は卵の中心からの距離、及びある任意の基準線からの角度の二成分で表わすことができる。そこで、精子のある一定時間内の軌跡の、精子と卵の中心からの距離の変化量を測定して、進化性の指標とした。

　この定量法を用いて、次に受精前後における卵の精子活性化・誘引能の変化を解析した。Ca²⁺欠如海水処理で卵から濾胞細胞を除去し、受精前後の精子誘引活性の変化を経時的に観察し、走化性指標を算出して統計処理を行なった。その結果、受精直後に起こる卵形変化を境に有意に精子走化性がなくなることが示された(図1)。

図1.受精前後における走化性指標の時間変化○:精子走化性指標。説明本文参照。

　以上の結果は精子活性化物質が未受精卵から海水中に放出されることを示している。実際卵を約12時間入れておいた海水(卵海水)は、卵を取り除いても精子を著しく活性化する。また卵海水を加えた寒天を微小ガラス管の先端に充填して精子懸濁液中に浸すと、精子はまず活性化され、次にその先端に向かい走化性を示した。これらの結果は卵海水中には精子活性化物質ばかりでなく精子誘引物質が含まれていることを示している。一方、cAMP分解酵素であるphosphodiestraseの阻害剤であるtheophyllineを充填したガラス管は精子を活性化するが、精子誘引性は示さなかった。しかし卵海水を充填した先端はtheophyllineであらかじめ活性化した精子を誘引する。従って精子活性化機構にはcAMPが関与するが、走化性機構には関与しない、すなわち精子活性化機構と走化性機構は全く別の機構であることが考えられる。

　第1部で述べたように、ユウレイボヤ卵海水には強力な精子活性化及び精子誘引活性がある。そこで、この卵海水を出発点として精子活性化・誘引物質の精製を行なった。ユウレイボヤ1500匹より得た1.21の卵海水を凍結乾燥し、エタノール抽出及びクロロホルム-水系二層分配を行ない、それぞれエタノール可溶画分、水画分から活性成分を回収し、粗精製標品を得た。これをSepPak C18逆相分配カラム、及びShim-pak PRC-ODS、TSKgel ODS 120Tの3種のHPLCカラムで順次精製し、205nmの紫外吸収に単一ピークを持つ活性標品を得た(図2)。この活性標品は依然として精子活性化能と精子誘引能両方を備えていることから、2種の活性は同一物質によるものと思われる。そこで私はこの物質を精子活性化・誘引物質(Sperm-Activating and -Attracting Factor;SAAF)と命名した。このSAAFの活性は非常に強く、ガラス微小管の先端にこれを充填して精子懸濁液中に入れたところ、ガラス管のまわりの精子は即座に活性化され、卵海水ではあまり観察することができなかった"chemotactic turn"と呼ばれるカーブを描きながらガラス管の先端に集まる様子が観察された。

図2.TSKgel ODS-120Tの溶出パターン●:精子活性化活性;実線:205nmの吸光度。(+)精子誘引活性強、(±)弱、(-)なし。説明本文参照。

　SAAFの化学的性質を調べるため、まずこの標品を煮沸30分行なったがその活性は損なわれなかった。また3種のタンパク質分解酵素、グリコエンドペプチダーゼA、7種のレクチンをこの標品に作用させたが、いずれも精子活性化・精子誘引のどちらの活性にも影響を与えなかった。この結果はSAAFがタンパク質ではないこと、SAAF分子の中に糖鎖が含まれないかもしくは活性部位には関係していないことを示している。この活性を持つ物質は酸性の低分子物質であることも示唆されており、現在この物質の構造解析を試みている。

　多くの生物の精子走化性現象には外液中のCa²⁺が不可欠であること、またユウレイボヤやニジマスの界面活性剤による精子除膜モデルは、その再活性化にcAMPが必要であることが知られている。このことは精子の運動にはCa²⁺及びcAMPが関与していることを示唆している。そこでSAAFによるユウレイボヤ精子活性化及び走化性の分子機構について、Ca²⁺とcAMPに注目して検討した。まずCa²⁺欠如海水中に懸濁したユウレイボヤ精子にSAAFを作用させたが、精子活性化現象は見られなかった。しかしこれにCa²⁺を加えると精子は著しく活性化した(図3)。また、3種のCa²⁺ channel阻害剤のSAAFによる精子活性化に対する作用を調べたところ、L型channel選択的阻害剤であるnitrendipine,verapamilは全く阻害作用を示さなかったのに対し、T型channel選択的阻害剤であるflunarizineだけが強い阻害作用を示した。以上の結果はSAAFは精子細胞膜のT型Ca²⁺ channelを開き、細胞外からCa²⁺を流入させ、それによって精子活性化が起こることを示唆している。

図3.SAAFによる精子活性化に対するCa²⁺の影響○:精子運動率。SAAFを精子懸濁液に加え(矢頭)、30秒後にCa²⁺を加えた(矢印)。説明本文参照。

　次にcAMPの作用について検討した。phosphodieateraseの阻害剤、theophyllineは、細胞内のcAMP量を亢進させる働きを持つ。第1部でも述べたようにtheophyllineはユウレイボヤ精子を海水中で活性化するが、この作用はCa²⁺欠如海水中でも見られた。SAAFはCa²⁺欠如海水中では精子を活性化しないことから、theophyllineによる細胞内cAMPの上昇がCa²⁺に関係なく精子を活性化すると考えられる。そこで、SAAFによる精子内のcAMP量の変化を¹²⁵I-cAMPを用いたradioimmunoassay法で調べた。Ca²⁺欠如海水中に懸濁した精子にSAAFを作用させたところ、cAMP量は変化しなかったが、これにCa²⁺を添加し運動を活性化する条件にしたところ、cAMP量が約4倍に増大した(図4)。このことはSAAFにより細胞外から流入したCa²⁺がadenylyl cyclaseを活性化することなどによってcAMP量を増大させ、このcAMPが精子活性化を引き起こすことを示している。

図4.SAAFによる精子活性化時の細胞内cAMP量の変化SAAFを精子懸濁液に加え(矢頭)、35秒後にCa²⁺(○)もしくはCa²⁺欠如人工海水(●)を加えた(矢印)。説明本文参照。

　ところで、このCa²⁺欠如海水中に懸濁したtheophylline活性化精子中にSAAFを先端に充填したガラス微小管を入れたところ、精子はガラス管先端のSAAFに走化性を示さず、円運動をするのみであった。しかし外液中にCa²⁺を添加すると急に精子運動の軌跡が変化し、SAAFに対して走化性を示すようになった(図5)。この結果は精子走化性にはCa²⁺が不可欠であるが、Ca²⁺によるcAMPの増加といった機構は走化性現象には働いていないことを示す。SAAFは単一の物質であると考えられるので、精子活性化と精子走化性は1つの物質が違った経路を介して別の作用を起こしていると考えられる。

図5.SAAFに対する精子走化性に対するCa²⁺の影響(A)Ca²⁺添加前;(B)Ca²⁺添加後。説明本文参照。

　以上のように、ユウレイボヤにおける精子運動開始及び精子走化性機構についての今回の研究により、ユウレイボヤ卵は精子活性化・誘引物質を卵の付属細胞ではなく卵細胞自身の植物極付近から放出していることを明らかにした。この精子活性化作用及び誘引作用は単一の非タンパク質性の低分子物質SAAFにより引き起こされる。SAAFは精子の細胞外Ca²⁺の流入を引き起こし、それによって細胞内cAMPが上昇し、精子の運動を活性化する。一方、SAAFに対する精子走化性には細胞外Ca²⁺が大きく関与し、細胞内cAMPの上昇は直接に関与しない。今後は今回の結果をふまえ、精子活性化・走化性の分子機構についてさらに詳細な研究を行なう予定である。