 玉明の提出した論文は、哺乳類精子において、精子形成以後に起こる運動の活性化、すなわち、精子の運動の原動力たる鞭毛運動の調節に関する研究の成果をまとめたものである。哺乳類の精巣上体の精子は、種に固有な様々な要因によって運動を抑制されており、射精されることによって活発な運動を開始する。これは精子の活性化とよばれるが、この分子レベルでのメカニズムはあまり良くわかっていない。この運動調節のメカニズムを明らかにすることは、生物界に広く存在する微小管系の運動装置、特に鞭毛や繊毛の運動機構を明らかにする上で大変重要な意義を持つ。また精子の運動調節を通じて、男性側の原因による不妊の治療や避妊といった医学的な問題や、畜産関係への応用などを通じて、社会的貢献が期待される。 今までの研究によって、多くの動物で共通する、精子運動の活性化の機構があることが分かってきた。すなわち、様々な動物種において、精子活性化を引き起こす固有な外部シグナルがあるが、それらは細胞内へ伝達されると、多くの動物に共通の細胞内シグナルであるcAMPの合成を高め、その結果、タンパクリン酸化酵素が活性化されて、ある特別なタンパク質がリン酸化され、それが運動器官である鞭毛軸糸の運動を調節するというものである。しかしながら、この経路で最も重要と考えられる、タンパク質のリン酸化がどのようにして鞭毛軸糸の運動を調節しているのかという問題に関しては、ほとんど手つかずの状態であった。本論文においては、マウスやハムスターで、運動活性化の鍵を握ると考えられるリン酸化タンパクが、それぞれ、65KDおよび40KDであると同定した。そしてこれらのリン酸化に伴って、微小管相互の結合様式と滑り速度が変化することが、精子の活性化においてみられる鞭毛屈曲の増大と振動数の増加をもたらすことを明らかにした。これは生理レベルでの鞭毛運動の活性化という現象を、微小管の滑りとその調節タンパク質のレベルまで掘り下げた画期的な内容である。また哺乳類に特有な繊維鞘の滑り運動を発見し、そのメカニズムを解析したが、これは鞭毛運動の開始機構などを考える上で、多くの示唆を含んでいる。このように、本論文で述べられた多くの研究の成果は、この分野においてきわめて重要なものであり、今後の発展に多大な貢献をなすと考えられる。 本論文は3章からなる。第一章では、マウス精子の細胞外活性化因子が、重炭酸イオンであることをまず示し、次に界面活性剤で細胞膜を除去した精子鞭毛軸糸からの微小管の滑り出し運動が、タンパク質リン酸化を伴って変化することを明らかにした。第二章では、ハムスター精子を用い、外部活性化因子が、カルシウムイオンであるが、鞭毛軸糸内では、マウスと同様な調節機構が機能していることを示した。また、リン酸化されるタンパク質の局在と機能の検証をそれに対する抗体を用いて行った。第三章では、微小管の滑り出し運動に伴って、哺乳類精子に特有の繊維鞘が滑る現象を発見し、その機構について明らかにした。 第一章においては、マウス精子を用いて運動活性化の機構にって調べた。等浸透圧のショ糖溶液中では、精巣上体由来マウス精子の運動性は低いが、重炭酸イオンを加えると、精子は活性化されて高い運動性を示すことから、重炭酸イオンはマウス精子の活性化の細胞外要因であると考えられる。次に、ショ糖溶液に希釈した運動性の低い精子を、界面活性剤Triton X-100で処理し、細胞膜を除去し、Mg-ATPを含む再活性化溶液に懸濁すると、精子の鞭毛運動は起こらなかったが、ここにcAMPを加えると、精子は活発に運動を始めた。一方、重炭酸イオンで活性化させた精子を除膜した場合には、cAMPがなくても活発に運動を行なった。これらの結果から、cAMPはマウス精子の活性化を引き起こす細胞内の要因であると考えられる。 次に、除膜したマウス精子鞭毛をトリプシンで弱く消化した後、Mg-ATPを含む溶液でかん流すると、微小管は精子鞭毛から滑り出した。活性化されていない精子の鞭毛における微小管は、鞭毛の尾部から基部方向に滑り出したが、この滑り出した微小管は中片部では軸糸から離れず、中片部の尾部よりにループを形成した。一方、活性化した鞭毛においては、微小管は中片部の軸糸から離れ、基部と尾部の間にループを作った。そして微小管の滑り速度は、活性化されていない精子鞭毛のものと比較して速かった。また、活性化されていない除膜精子にcAMPを作用させると、活性化されたものと同様の滑り出しパータンと、同様の滑り速度を示した。これらの結果は、精子活性化の前後で微小管相互の滑り運動の様式がcAMP依存的に変化することを示している。次にSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、オートラジオグラフィーを用いて精子鞭毛活性化に関与するcAMP依存性タンパク質のリン酸化について調べた。その結果、マウスの精子では、cAMPに依存してリン酸化されるタンパク質の中で、65kDタンパク質が運動活性化に連動してリン酸化されるので、これが精子鞭毛運動活性化の鍵を握っていると考えられる。 第二章では、第一章の結果をハムスターで確かめると共に、免疫学的手法を用いてリン酸化タンパク質の局在と機能を明らかにした。ハムスターの精子は、細胞外のカルシウムによって運動が活性化される。精巣上体から取り出した活性化されていないハムスター精子の鞭毛と、カルシウム溶液で希釈して活性化された精子の鞭毛を除膜し、微小管の滑り特性を比較した。活性化されていない鞭毛では、滑り出した微小管はマウス精子の場合と同様、中片部では軸糸から離れずに、中片部の尾部よりにループを作ったが、活性化された鞭毛では、滑り出した微小管は中片部の軸糸から離れ、基部と尾部の間にループを作った。そして微小管滑り速度についてもマウス精子と同様に、活性化されたものの方が速かった。さらに、活性化されていない除膜精子にcAMPを作用させると、滑り出した微小管は、活性化されたものと同様の滑りパータンと速度を示した。オートラジオグラフィーを用いて調べたところ、ハムスターの精子が活性化する場合には、マウス精子とは異なり、40kDタンパク質がCAMPに依存してリン酸化されることが明らかになった。そのリン酸化タンパク質をポリアクリルアミドゲルのバンドから切り出し、それを抗原としてマウスに注射し、ポリクローナル抗体を調製した。この抗体を用いた蛍光抗体法により、40KDタンパク質が精子鞭毛の中片部に存在することが観察された。また、この抗体は活性化された精子鞭毛中片部の微小管の滑り運動を阻害し、活性化された精子鞭毛での微小管の滑り出しの位置を中片部の尾部よりに変えることが観察された。これらの結果から、この40KDタンパク質がリン酸化されることによって、ハムスター精子の活性化が引き起こされると考えられる。 第三章では繊維鞘の滑り運動の発見について述べている。鞭毛、繊毛の中央を貫く軸糸は、一般に、中央部の1対のシングレット微小管と周辺の9本のダブレット微小管からなる、いわゆる9+2という規則的な構造をとっている。哺乳類精子では、周辺の9本のダブレット微小管の外側に、電子密度の高い9本の外側粗大繊維が見られる。さらに精子の中片部では、ミトコンドリアがその外側を螺旋状に包んでおり、尾部では、ミトコンドリアに代わって繊維鞘が外側を包んでいる。第一章で述べたように、マウス精子を除膜後、トリプシンで弱く消化し、Mg-ATPを加えると、数本の微小管が軸糸中片部から基部方向へ滑りす。電子顕微鏡観察の結果、その滑り出した微小管はダブレットの4,5-6,7番のグループであり、なかでも、第5-6番微小管が最も早く滑り出すことが分かった。そしてその際、鞭毛後半を囲む繊維鞘が頭部方向に滑ることを発見した。繊維鞘の滑りはcAMPを必要とし、滑り速度はMg-ATP濃度に依存する。しかし高濃度トリプシンで消化した場合には、繊維鞘の滑りは観察されなかった。繊維鞘の滑る原因としては鞭毛軸糸中の微小管が滑り出す時、それらの外側に付着している外側粗大繊維と、それに接している繊維鞘が一緒に精子頭部方向へひっぱられるということが考えられるが、外側粗大繊維と繊維鞘の間に能動的な滑りが発生している可能性も考えられ得る。これらの結果は、哺乳類精子の鞭毛運動について、単に軸糸微小管の滑りだけでなく、他の鞭毛構成要素も考慮する必要があるとを示唆する重要な知見であると考えられる。 以上のように、本論文は、精子の運動活性化の機構について、生理学的現象と分子レベルでの調節機構を結ぶ上で、きわめて重要な意味を持つ結果が多数記載されており、この分野の研究に多大な貢献をなしたと評価できる。よって本論文提出者である玉明は学位を受ける十分な資格があると認められる。 なお本研究のうち、第二章の一部を除いて既に公表もしくは公表予定である。そしてこの残された第二章の一部も投稿中である。これらはいずれも共著論文であるが、それらの研究の計画や遂行はほとんど全て本論文提出者によってなされた。今後本論文提出者による更なる研究の展開が期待される。 |