本研究でクローン化した2種類のイネアデニレートキナーゼのcDNA(Adk-a,Adk-b)は、各々241アミノ酸、243アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを有しており、両者の相同性は塩基レベルで73.7%、アミノ酸レベルで90.8%であった(図1)。RFLPによるイネ染色体上へのマッピングにより、Adk-aが第12染色体、Adk-bが第11染色体上に位置する事を示した。また、本cDNAが大腸菌の温度感受性アデニレートキナーゼ欠損株(CV2)をレスキューすることから、活性の有るアデニレートキナーゼタンパク質をコードすることが明らかとなった。

　次に、AK-a、AK-bタンパク質の生化学的性質を調べた。すなわち、pET発現ベクター(pET11d-GST)のクローニングサイトにAdk-a、Adk-bのコーディング領域をフレームを合わせて組み込み、大腸菌内でグルタチオンS-トランスフエラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させた(図2)。さらに融合タンパク質をトロンビンで処理し、グルタチオンカラムによってGST部分を除き、AK-a、AK-bタンパク質を精製した。これらを用いて酵素反応の基質特異性を調べたところ、リン酸基の受容体としてはAMPへの特異性が非常に高いが、リン酸基の供与体としてはATPのみでなく、他のヌクレオシド3リン酸(GTP,CTP,TTP)もわずかに利用できることが明らかとなった。また、様々なpH溶液の処理による失活度の検定、基質のアナログであるAp5Aによる反応阻害実験(図3)は、両酵素タンパク質が類似の生化学的性質を有する事を示した。

　アデニレートキナーゼタンパク質の細胞内局在を調べるため、イネ培養細胞の抽出物を細胞分画し、各フラクションをアデニレートキナーゼの活性測定に供した。その結果、ナイトゾルが主である100,000xg上清に高い活性が測定された。さらにアデニレートキナーゼタンパク質の局在を調べる目的で、本タンパク質に対するポリクローナル抗体を作成した。得られた抗血清はプロテインAセファロースカラム、アデニレートキナーゼタンパク質(抗原)を固定したアフィニティーカラムにより精製し、AK-a,AK-bを共に認識する抗体を得た。本抗体を用いて、イネの各器官の粗抽出液でウェスタンプロット解析を行なった。発現量に差は認められたが、根、葉、およびカルスに約27kDaのアデニレートキナーゼタンパク質が検出された(図4)。また、ティッシュプリント解析から、本タンパク質が主に維管束組織に存在する事が明らかとなった。

　以上の結果より、イネアデニレートキナーゼタンパク質の発現は、細胞内では主にサイトゾルに、植物体では主に維管束組織に分布している事が示された。

　生体内のアデニンヌクレオチドバランスの維持に対するアデニレートキナーゼの寄与を解析する為、異なるストレス下におけるアデニレートキナーゼの発現応答を調べた。すなわち、播種4日目のイネ芽生えを温度、浸透圧、塩、光、冠水処理し、アデニレートキナーゼの酵素活性の変動を測定した。その結果、温度(10℃、37℃)、浸透圧、冠水で共通したアデニレートキナーゼの活性上昇が認められた。

　本研究では、イネが特に水環境に適応した植物である事から、冠水処理とアデニレートキナーゼの発現応答の関係を明らかにする目的で、さらに実験を行なった。イネ芽生えを冠水処理する事により、根の伸長阻害、子葉鞘の伸長等の形態的変化が認められるが、冠水処理下でのアデニレートキナーゼの活性上昇は、全ての器官で認められた。冠水処理は植物にとって、水との接触による物理的ストレス、酸素の欠乏による嫌気ストレスを引き起こすと考えられる。そこで、窒素ガス供給条件下でイネ芽生えを生育させた。この時、アデニレートキナーゼの活性上昇が認められる事、さらに部分的な冠水処理(イネ芽生えの先端部5mmを空気中に露出)では、アデニレートキナーゼの活性上昇は検出されない事から、冠水処理時に検出されたアデニレートキナーゼの活性変動は、水との接触による物理的ストレスではなく、生体内の嫌気状態に応答している事が示された(図5)。さらに、冠水処理によるアデニレートキナーゼのmRNAの蓄積パターンは、アルコールデヒドロゲナーゼや、ピルベートジカルボキシラーゼなどの嫌気誘導性の遺伝子群と類似の発現パターンを示した(図6)。次に、冠水条件下における内生アデニンヌクレオチドの量的変化を、HPLCを用いて定量した。その結果、細胞内のアデニンヌクレオチドバランスは酸素呼吸の阻害にも係わらず、ほぼ一定であった。

　アデニレートキナーゼの発現量と植物生長との関係を解析する為、カリフラワーモザイクウィルスの35Sプロモーターの下流にアデニレートキナーゼcDNAをセンス、又はアンチセンス方向に連結し、エレクトロボレーション法によってイネのプロトプラストに導入した。その結果、センス、またはアンチセンス方向に遺伝子を組み込んだトランスジェニックイネを各々10系統以上得た。再分化個体の葉におけるアデニレートキナーゼ活性は、非形質転換体に対しセンス植物では約20%の増加、アンチセンス植物では50%の減少を示した(図7)。その結果、アデニレートキナーゼをセンス方向に組み込んだ植物では、非形質転換植物との間に際だった差異は認められなかったが、アデニレートキナーゼの活性を抑制したアンチセンス植物では生長の遅れ(図8)、穎果の発達不良等の生育阻害が見られた。この事は、アデニレートキナーゼが植物の発育、生長に重要であることを示唆している。

図表図1 イネアデニレートキナーゼ(AK-a,AK-b)の予想されるアミノ酸配列 cDNA(Adk-a,Adk-b)の塩基配列から予想されるアミノ酸配列を示した。★は同一アミノ酸を、ボックスで囲んだ領域は基質の結合部位と考えられるアミノ酸を示している。 / 図2 AKタンパク質の大腸菌内での発現 AKcDNA(Adk-a,Adk-b)のタンパク質コード領域を発現ベクターに組み込み(A)、IPTG添加(+)、非添加(-)での大腸菌内の発現をSDS電気泳動で調べた(B)。 / 図3 基質アナログAp5AによるAK反応阻害 Ap5を加えないときの値を100として示した。■,AK-aのATP合成反応;□,AK-bのATP合成反応;●,AK-aのADP合成反応;○,AK-bのADP合成反応 / 図4 イネにおけるAKタンパク質の発現 発芽後2週目のイネ芽生えの根と葉、さらにカルスの抽出液を用いてウェスタンプロット解析を行った。1レーンあたり10gのタンパク質を含む。 / 図5 冠水処理、窒素ガス処理によるAK活性の変動 発芽4日目のイネ芽生えを完全な冠水処理、部分的な冠水処理、窒素ガスによる嫌気状態におき、AKの活性を経時的に測定した。 / 図6 冠水処理におけるAKmRNAの蓄積 Adk-aのコード領域をプローブとして、ノーザンプロット解析を行い、イメージアナライザーで定量した。最大の値を100として表した。 / 図7 トランスジェニック植物におけるAK活性 得られたトランスジェニック植物の葉におけるAK活性を測定した。 / 図8 培養中のトランスジェニック植物 AK活性を抑制したアンチセンス植物で生長の遅延が認められた。