ニンジンの不定胚発生には通常、2,4-D存在下で維持しているカルスのうち、メッシュサイズ37-106mの小さな細胞群、即ち、PEMs(proembryogenic masses)を用いる。これを2,4-Dを除去した培地で培養することにより、球状胚、ハート型胚、魚雷型胚と発生は進行する。球状胚、ハート型胚、魚雷型胚は-2,4-D培地での培養期間、及び胚の大きさにより分離することができる。そこで、rolCプロモーター(-848bp/+23)とuidA遺伝子との融合遺伝子を導入した形質転換ニンジンを用い、不定胚の各発生段階におけるGUS活性の変動を解析した。その結果、GUS活性の上昇は、PEMsから球状胚、球状胚からハート型胚が形成される過程で観察された(図1)。

　ニンジンの不定胚誘導系においては、ハート型胚(メッシュサイズ180-250m)をサンプリングする際、これより小さな胚の画分より球状胚(メッシュサイズ63-150m)を得ることができ、魚雷型胚(メシュサイズ300-355m)をサンプリングする際には、これより小さな胚の画分よりハート型胚、球状胚をそれぞれ得ることができる。これらの胚でのGUS活性を比較することにより、rolCプロモーターの発現活性の上昇が不定胚誘導培地(-2,4-D)での培養日数に依存しているのか、或いは不定胚発生の進行に依存しているのかを検討した。その結果、それぞれの球状胚でのGUS活性は一定に保たれていた。一方、ハート型胚、魚雷型胚でのGUS活性はそれぞれの球状胚でのGUS活性よりも高い値を示した。したがって、rolCプロモーターの発現活性の上昇と、不定胚発生との間で相関が存在することが示された。本研究では、この様なプロモーターの活性化をSERA(Somatic-Embryogenesis-Related Activation)と以下呼ぶことにする。

　不定胚発生に伴う発現活性を制御するシス領域の同定を試みた(図2)。その為、rolCプロモーターの5’上流域を順次欠失し、uidA遺伝子を連結させたキメラ遺伝子を導入した形質転換体を作成した。5’上流域を-848bpから-255bpまでを順次欠失した場合、不定胚でのGUS活性は徐々に低下したが、カルスより高い値を示した。さらに-230bpより5’上流側を欠失させたところ、GUS活性はカルス、不定胚共にバックグランドのレベルまで低下した。

　以上の結果より、SERAを担うシス領域は、-255bpより転写開始点側に存在することが示唆された。そこで、-255bpより5’上流域を残し、転写開始点側を中間欠失させたプロモーターを作製し、これらの不定胚の発生段階における発現パターンを解析した。その結果、最も欠失領域の大きい-255bpより+2bpを欠失させた場合においても、SERAは認められた(図2)。したがって、rolCプロモーターの不定胚発生に伴う発現活性を制御するシス領域は、-255bpより5’上流側と転写開始点側の2つの領域、もしくは+2bpから+23bpの領域のみであると推察された。

　そこで、rolCプロモーター領域とCaMV35Sのコア領域(-90bp/+6bp)とを組み合せた融合プロモーターを用い、解析を行った。その結果、rolCプロモーターの-848bpから-94bpを35Sコア領域の上流に組み込んだ場合、SERAが検出され、+2bpから+23bpにのみ存在する可能性が否定された。一方、-255bpから-94bp、または-848bpから-255bpの領域を35Sコア領域の上流に組み込んだ場合、SERAが認められなかった(図2)。以上の結果より、不定胚における遺伝子発現の制御にはrolCプロモーター上の複数の領域が関与している事が示された。

　SERAが検出された最小領域である-255bpから転写開始点側を含む領域に注目し、この領域を含む3種類のDNA断片(A;-271bpから-174bp、B;-203bpから-92bp、C;-94bpから+23bp)への粗核抽出物のDNA結合活性をゲルシフト法により解析した。DNA断片Aをプローブとした場合、少なくとも3種類のDNA結合因子が検出された(図3A)。AII、及びNaはPEMs、球状胚においてDNA結合活性の低下が認められた。DNA断片Bに対しては、球状胚で最も高い活性を示すBI、及びPEMs、球状胚で活性の低下するNbが観察された(図3B)。DNA断片Cにより検出されるCI、及びNcはPEMs、球状胚において低下した(図3C)。これらの結果より、不定胚発生の進行には複数の異なるDNA結合因子の関与が示唆される。

　rolCプロモーターへのDNA結合因子のうちBIは、球状胚で最大の活性を示し、本プロモーターの発現活性と正の相関を有するので、以下の解析を行った。即ち、DNaseIフットプリント分析の結果、上鎖では-217bPから-l74bp、-160bpから-137bp、-120bpから-93bpの領域が、下鎖では-207bpから-l76bp、-164bpから-98bpの領域がDNaseIによる切断から保護され、これらの領域にBI因子が結合していると予想された。そこで、-217bpから-174bp(B-1)、-164bpから-137bp(B-2)、-120bpから-93bp(B-3)に相当する合成オリゴヌクレオチドを用い、競合実験を行った。その結果、B-1あるいはB-3を反応液に加えた場合、DNA-BIタンパク質複合体の形成が抑えられた(図4)。したがって、BI因子はrolCプロモーターの領域B-1とB-3に結合していると推測される。領域B-1とB-3には共通配列TAAT^A/_TANTAAが存在する(図5)。同様の配列はrolCプロモーターの-255bpよりも5’上流側の-728bpから-719bpにも存在する。以上の結果は、第II章のシス領域の解析結果、即ち「SERAのシス領域は、-255bpより5’上流側と転写開始点側の少なくとも2つの領域に存在している」と矛盾せず、これらの配列がrolCプロモーターの発現制御に関与していると考えられる。