細胞の増殖・分化過程におけるオルガネラ核の動態を調べるには、組織内のどの細胞でいつオルガネラDNAが合成されるかを調べねばならない。従来、組織内におけるDNA合成部位の解析には、[³H]thymidineなどを使ったミクロオートラジオグラフィーが主に用いられてきたが、微小なオルガネラ核におけるDNA合成を研究するにはより高い解像度が必要であった。そこで、tymidineのアナログである5-bromo-2’-deoxyuridine(BrdU)を取り込ませた試料をテクノビット樹脂に包埋し、DNAに取り込まれたBrdUの局在を間接蛍光抗体法で検出する方法を確立した。その結果、組織内においてオルガネラ核レベルでのDNA合成部位の決定が可能になった。

　オルガネラDNAの増幅の意義を調べるには、DNA増幅と遺伝子発現との関係を調べることが必須である。組織レベルでのmRNAの局在を調べるのに用いられる従来のISH法では解像度が低く、個々のオルガネラを認識しながらその遺伝子発現を調べるのは困難である。そこで、テクノビット樹脂を利用した高解像度ISH法を開発し、細胞内でのRNAの局在を半定量的に調べることを可能にした。テクノビット樹脂にポリエチレングリコールを混合して重合させることで試料の反応性を高め、さらに、検出に3次抗体まで用いるなどの改良を加えた。その結果、検出感度が著しく向上し、個々の色素体内におけるpsbA,rbcLなどのmRNAの発現が検出できるようになった。

　高等植物の根端分裂組織の先端部におけるDNA合成をミクロオートラジオグラフィーで調べると、細胞核がラベルされる頻度が著しく低い静止中心と呼ばれる領域が存在する。これが、静止中心の一部の細胞が全く細胞分裂をしないため生じているのか、全ての細胞で細胞分裂周期が長いためなのかについての知見はなかった。そこで、シロイヌナズナの芽生えをBrdU存在下で培養し、静止中心近傍、とくに静止中心の先端に位置する中心細胞でのDNA合成を詳細に検討した。24時間の培養で中心細胞の細胞核は7.7%が標識され、全ての細胞でオルガネラ核でのDNA合成が確認された(表1)。これは、シロイヌナズナの静止中心を形成している細胞は、その全てが非常に長い細胞分裂周期で増殖中であり、完全に静止しているのではないことを明瞭に示している。

　根端分裂組織における細胞核とオルガネラ核のDNA合成活性の変化とそれに伴うオルガネラ当たりのDNA量の変化は、細胞質やオルガネラ内でのRNAの量的変化を伴っている可能性が考えられる。そこで、根端分裂組織における細胞質とオルガネラのrRNAの密度分布をテクノビットISH法で半定量的に調べた。細胞質の25SrRNAの密度は、中心細胞を含む根端先端部で低く、細胞分裂が活発な分裂組織中部では高くなり、細胞分裂が停止し分化が進行する分裂組織上部では再び低くなった(図2A、B)。こうした細胞質中のrRNA量の変動はレタスなど他の植物種の根端でも観察され、細胞分裂速度と細胞質のrRNA量には相関があることが予想される。一方、色素体では、分裂組織先端部のDNA含量が多いものでも、分裂組織中部のDNA量が少ないものでも、rRNAの密度は同様に低かった。従って、根端先端部におけるオルガネラDNAの選択的増幅は、転写産物の量を増やすためではないと考えられる。

　茎頂分裂組織から普通葉が形成される過程においても、色素体とミトコンドリアDNAの特異的増幅・分配が行なわれることを修士課程で明らかにした。

　茎頂におけるオルガネラDNAの特異的増幅・分配も根端と同様に細胞核・ミトコンドリア・色素体の三者でDNA合成の活発な時期が異なるために生じると考えられる。しかし、解像度および感度の面から従来のミクロオートラジオグラフィでは茎頂におけるDNA合成を解析するのは困難であった。そこで、BrdU-テクノビット法を用いて、シロイヌナズナの芽生えの茎頂における三者のDNAの合成が活発になる時期を調べた。DNA合成のビークはミトコンドリアは吸水開始後3.5日目以前、細胞核は4.5日にあり、色素体では7日目になっても合成は続いていた(表2)。オルガネラのDNA量がまずミトコンドリアで増え、続いて色素体で増えることが明らかになった。

　この普通葉形成過程の初期に見られるオルガネラ、特に色素体のDNAの増幅は葉緑体の発達、分化の過程で必要な大量のRNAを供給するのに役だっている可能性がある。そこで、テクノビット樹脂を用いたISH法で普通葉の発生過程における個々の色素体内のRNA量の変化を調べた。最初に色素体の23SrRNAについて解析した結果、根端とは異なり高レベルで蓄積されていることが確認された。rRNAの密度は吸水開始後4〜7日まで高かったが、さらに色素体の成熟が進行するとその密度は減少した(図3)。

　同様にして、色素体にコードされるmRNAの発現を調べた。葉緑体に最も多く含まれるmRNAであるpsbA転写産物量の変化を調べた。普通葉の形成過程において、psbAは、吸水開始後約3日目から弱いシグナルが検出され、5日目には急増した。そのシグナルは10日目にはrRNAと同様に弱くなった(図4)。rbcLのmRNA量を調べたところ、全般的にシグナルは弱いがpsbAと類似した増減の傾向を示した。以上3種のRNAの増加はDNAの増幅が生じてから起きており、これはDNAの増幅が葉緑体の遺伝子発現に分化の過程で重要な役割を果たすことを示唆している。

図表表1 シロイヌナズナの中心細胞の、細胞核とオルガネラ核がBrdUを取り込んだ細胞の頻度(%) / 図1 シロイヌナズナ静止中心近傍でのDNA合成。A,CはDAPIによるDNAの染色。B,Dは間接蛍光抗体法によりBrdUが取り込まれた場所を検出している。 / 図2A シロイヌナズナ根端でのrRNAの密度の変化。(A)A,CはDAPIによるDNAの染色。B,Dは25SrRNAをプローブとした、in situハイブリダイゼーションにより細胞質におけるrRNAの密度の変化を検出した。検出は間接蛍光抗体法により行なっている。(B)シロイヌナズナ根端分裂組織におけるrRNA量の変化。in situハイブリダイゼーションのシグナルを表す蛍光を顕微蛍光定量装置を用いて測定し、中心細胞に対する相対値として表した。 / 表2 12時間のBrdU処理ででラベルされた、細胞核、ミトコンドリア色素体の割合(%) / 図3 第1葉の形成過程における、23SrRNAの発現。(A,B)は、吸水後3日目、(C、D)吸水後5日目、(E,F)吸水後7日目、(C,R)吸水後10日目の普通葉。A,C,E,GはDAPIによるDNAの染色を、B,D,F,Rは間接蛍光抗体法による23SrRNAの局在を示している。 / 図4 第1psbAの発現。(A,B)は、吸水後3日目、(C,D)吸水後5日目、(E,F)吸水後7日目、(G,H)吸水後10日目の普通葉。A,C,E,GはDAPIによるDNAの染色を、B,D,F,Hは間接蛍光抗体法によるpsbAのmRNAの局在を示している。

　さらに、RuBisCO(ribulose bisposphate carboxylase/oxygenase)大サブユニットタンパク質の発現時期を間接蛍光抗体染色法で解析した。色素体中のRuBisCOタンパク質の量は色素体DNAの増幅が開始される3日目では非常に少ない。その後、RuBisCOタンパク量はDNA量の増幅が起きる4日目から増加し、5日目以降の葉緑体は大量のRuBisCOを含んでいた(図5)。

　根端と茎頂では、細胞増殖とオルガネラ分化が平行して生じる。そこで、細胞数の変化を伴わない子葉の系でオルガネラ分化を調べた。修士課程で子葉の葉緑体の発達過程での色素体核の挙動を調べ、個々の葉緑体に含まれるDNAの量は大きくは変化しないが、分化の初期には大型である色素体核はチラコイドの発達につれ、細分されることをすでに明らかにしている。色素体核の小型化は膜の発達に伴って生じる可能性がある。より短時間に進行する色素体分化の系として、エチオプラストが緑化するときの色素体核の形態変化を調べた。暗所で培養したシロイヌナズナの黄化子葉に光を照射し、その後24時間の経時的なオルガネラの変化を組織化学的に調べた(図6)。暗黒下で色素体は、直径4.0±2.8mで、数個の色素体核を含んでいた。光を照射すると、3〜6時間目に時間の経過に伴って色素体核は周辺に移動して、環状にプロラメラボディを取り囲んでいた。24時間目には直径7.8±5mとなり、プロラメラボディからチラコイドが伸び、色素体核は膜の間に散在していった。色素体核が周辺に移動し、その後チラコイドの間に散在していく過程には色素体核と膜との間で何らかの相互作用が働いている可能性がある。顕微蛍光定量装置を用いて、光照射による緑化過程での個々の色素体のDNA量を調べたところ、24時間で2.5倍程度に増加していた。この比は、茎頂のプロプラスチドから葉緑体が形成される過程で生じる20倍の増加に比較すると小さく、DNA含量の観点からするとエチオプラストは葉緑体に近いことがわかった。

　次にエチオプラストの緑化過程における色素体内のRNAの挙動を蛍光ISH法で調べた。23SrRNAは、光照射後0時間でも大量に存在していた。6〜12時間目にプロラメラボディが発達すると、23SrRNAはDNAと同様にプロラメラボディを取り囲むように局在した。その後、チラコイドが発達し葉緑体への分化が進行すると23SrRNAは葉緑体全体に散在するようになった。psbAのmRNAは、暗黒下ではわずかな量しか認められなかったが、光照射後量が増えた。23SrRNAと同様にpsbAもプロラメラボディには認められず、DNAが存在している領域に見られた(図7)。さらに詳しい色素体内でのRNA、DNAの局在を調べるために、電子顕微鏡を用いたISH法でより詳細な動きを検討した。子葉の葉緑体でrRNAの局在を調べたところ、色素体核に含まれるrRNAの量は少なかった。

図表図5 第一葉の形成過程における、ルビスコ大サブユニットの発現。(A,B)は、吸水後3日目、(C,D)吸水後4日目、(E,F)吸水後5日目の普通葉。A,C,EはDAPIによるDNAの染色を、B,D,Fは間接蛍光抗体法によるルビスコ大サブユニットの色素体内における局在を示している。スケールバーは5m。N,細胞核;Mn,ミトコンドリア核;Pn,色素体核;Pt色素体、Mt,ミトコンドリア / 図6 黄化子葉の緑化過程における、色素体とミトコンドリアの膜構造の変化。光照射後24時間でのDAPIによるオルガネラ核の染色と、DiOC6染色によるオルガネラの膜構造の変化を示す。N,細胞核;Mn,ミトコンドリア核;Pn,色素体核;Pt 色素体、Mt,ミトコンドリア / 図7 エチオプラスト緑化過程における、psbA遺伝子局在。光照射後24時間でのpsbAのmRNAの局在の変化を高解像度in situハイブリダイゼーション法により検出した。psbAのシグナルは色素体上に点上に検出された。DAPIによるオルガネラ核の染色と、抗ルビスコ抗体によるルビスコの染色を示す。N、細胞核;Pn,色素体核;Pt,色素体 / 図8 エチオブラスト内でのルビスコタンパク質の局在。光照射後24時間でのDAPIによるオルガネラ核の染色と、抗ルビスコ抗体によるルビスコの染色を示す。N,細胞核;Mn,ミトコンドリア核;Pn,色素体核;Pt,色素体;Mt,ミトコンドリア

　エチオプラスト緑化過程でのRuBisCOの色素体内での局在の変化を間接蛍光抗体法で調べた。RuBisCO大サブユニットは、暗黒下でもエチオプラスト中に大量に観察された。光照射後のプロラメラボディの発達に伴って、rRNAとほぼ同様に色素体内での局在は変化した。シロイヌナズナでは、種子の登熟過程で作られたRuBisCOタンパク質が保持されている可能性がある。