私は修士課程において顕微鏡下で高濃度ファクター存在下でも突起を形成せずに伸長成長する変異株を5株取得しPPF1,PPF2,PPF3を同定した。しかし突起形成過程にはより多数の遺伝子が関与していると想定し、同様の方法でさらに変異株単離を徹底的に進めた。得られた変異株32株中のその表現形が核性の単一の遺伝子変異による27株と既知のppf変異について相補性試験を行った。得られた変異はすべてPPF1,PPF2,PPF3に起きていた(表1)。従ってこの形態的指標に基づく変異株単離はほぼ飽和していると結論した。またそれらの変異の大半はPPF1またはPPF3に集中して起こっていた。後に示すようにPPF1,PPF3は巨大なタンパク質をコードしており、その機能を不活化する変異が比較的入りやすいのかもしれない。

表1.新たな突起形成不能株の相補性試験

　次に各PPF遺伝子と既知の突起形成関連遺伝子BEM1,SSP31/SLK1/BCK1,SPA2,SST2,STE2との相補性試験を行った。その結果PPF1はSPA2と同一の遺伝子であることがわかった。その他の遺伝子が今回の変異株単離で同定されなかった理由としては特殊な変異座のみ突起形成不能を示す(BEM1,SST2,STE2)、またはその変異株は突起形成不能ではあるが明確な伸長成長を示さない(SSP31,SST2)ためスクリーニングにかからなかったものと思われる。

　次にppf2-1,ppf3-1変異株の解析を行った。変異株単離は34℃で行ったため以下の解析はすべて34℃で行った。

　MATa細胞に対する低濃度ファクターの作用としては増殖のG1期停止、一群の接合に関連した遺伝子の発現の誘導がある。ppf変異の低濃度ファクターの作用に与える影響についてこの両観点から調べてみたところ、野生株と変異株との間には顕著な差が見られなかった(図1)。このことはppf変異株においては低濃度ファクター作用で働く信号伝達経路は正常であることを示している。

図1.ファクターに対するMATa ppf細胞の反応性様々な濃度のファクターで34℃90分処理した後未出芽細胞の割合、およびFUS1遺伝子の発現の誘導を大腸菌lacZ遺伝子をレポーター遺伝子として用いることにより調べた。□PPF,○ppf2-1,ppf3-1.

　MATa細胞はファクターが作用し続けると適応を起こし遺伝子発現を停止し増殖停止から復帰するが、ppf変異株では明らかに適応開始時間が早まっていることが分かった(図2)。この適応反応の早まりは外部のファクター濃度の低下の違いによるものではなかった。このことはPPF遺伝子産物は内的な適応反応に関与していることを示している。

　次に、ppf2-1,ppf3-1変異の増殖期に与える影響について調べてみた。いずれの株も富栄養培地中では特に目立った増殖遅延は見られなかった。しかしながらppf3-1変異株は細胞質分裂に異常を示し超音波処理しても分離しない出芽を2つ以上持っている細胞が見られ、また出芽痕の直径が比較的大きなものも存在していた。このことからPPF3遺伝子産物はbud neck形成にも関与していると予想される。次に出芽パターンについて調べてみた。ppf3-1変異株では細胞質分裂異常のため母細胞と娘細胞との分離が不完全で凝集塊を成している細胞群が見られ正確な出芽パターンの解析は困難であった。そこで、遊離型の出芽を持つ2細胞のクラスターについてその出芽パターンを調べた。その結果ppf3-1変異株においてはMATa,MAT,MATa/MATすべてで出芽パターンに異常が見られた(図3)。このことはPPF3遺伝子は出芽位置決定にも関与していることを示している。

　PPF2及びPPF3遺伝子のクローニングを行った。ppf変異株の示す形態的な特徴によりPPF2,PPF3遺伝子をクローニングできるか検討してみた。34℃で150分間高濃度ファクター処理したppf変異株は全体の5%程度の細胞が突起形成をしていた(図4)。従ってこの方法では相補する遺伝子のクローニングはバックグラウンドが高く困難であると考えられる。一方ppf3-1変異株は合成培地中では野生株に比べて増殖速度が低下する。この形質を利用しppf3-1細胞を酵母ゲノムライブラリーで形質転換後、合成培地で増殖させることによりPPF3遺伝子を持つと考えられる細胞を濃縮し、顕微鏡下で突起形成能を回復した形質転換体を単離した。得られたDNA断片の最小相補領域の塩基配列を決定した結果、PPF3遺伝子は1953アミノ酸残基からなる親水性タンパク質をコードしていることが明らかになった。

　次にPPF2遺伝子のクローニングを試み、顕微鏡下で突起形成能を回復していると思われるライブラリープラスミドを導入した細胞を多数(〜2000)単離した。PPF2遺伝子を含むDNA断片を保持していたプラスミドが1つ得られ、その最小相補領域の塩基配列を決定したところ、PPF2遺伝子は420アミノ酸残基からなる親水性のタンパク質をコードしている新規の遺伝子であることが分かった。C末端付近にcoiled-coil構造をとると推定される領域が見いだされた(図5)ことから細胞内では二量体の形成または他のcoiled-coil構造を持つ蛋白質との相互作用が予想される。

　PPF2,PPF3遺伝子破壊株の表現形はそれぞれppf2-1,ppf3-1変異株とほぼ同一であった。またファクターに対する適応開始時間の異常は34℃で観察されたが30℃では起こらないことが分かった。このことはPPF産物が欠損したときに、適応過程においてその機能が温度感受性となる因子の存在を示唆している。

　MATa,MAT細胞は接合時、相手の分泌する接合フェロモンの濃度勾配を認識して多量のフェロモンを分泌する相手を選び接合することが知られている。この接合相手の選択には高濃度フェロモンを関知する能力が必要であると考えられている。ppf破壊株は接合相手を選択する能力は正常であったことから(表2)、接合相手の選択に必要な極性は正常に確立されており、PPF破壊株は高濃度フェロモンの認識とその情報の伝達は正常であると考えられる。

　次に出芽パターンについて詳細に解析を行った。PPF3破壊株もppf3-1変異株同様細胞質分裂異常を示し、出芽を持つ2細胞のクラスターについて出芽パターンを調べたところPPF3遺伝子破壊株はppf3-1変異株と同様に出芽パターンに異常が見られた。次に単一の出芽痕を持ちかつ1つだけ芽を出している細胞の出芽パターンを調べたところPPF3破壊株においてもそのパターンは全く正常であった。このことはPPF3破壊株においても細胞質分裂を正常に完了した比較的若い細胞の出芽位置決定は正常であることを示している。

　さらにPPF産物の機能を調べるためPPF2,PPF3を細胞内で多量発現させその影響を調べた。PPF2遺伝子を多コピーベクターで発現させたが特に影響は見られなかった。さらにPPF2プロモーターをGAL1プロモーターに取り替え強制発現させてそみたが特に影響は見られなかった。野生株においてPPF3を多コピーベクターで発現させたところ出芽パターンに若干の異常が起きた。顕著な異常はファクター処理時の突起形成に見られ、ファクター処理後突起形成不能細胞が25%程度現れたがその形態変化はPPF破壊株に見られる伸長成長と同一の形態のみではなく多様であった(図6)。これはPPF3の多量発現により極性が乱れたことを示唆しておりPPF3は極性確立に、または確立した極性を極性成長につなげる働きをしていることを示している。

図表図2.ファクターによる増殖停止からの復帰 10^-7Mファクター存在下(34℃)での増殖復帰を調べた。-galactosidaseは細胞中では比較的安定なため、その活性低下はlacZ遺伝子を発現していない細胞の増加によるものと考えられる。□PPF,○ppf2-1,△ppf3-1. / 図3.ppf変異株の出芽パターン イラストで示したように2細胞2出芽のクラスターについてその位置関係により分類した。ppf3株は若干の細胞質分裂異常を示すため、大きなクラスター中の細胞の出芽パターンはこのデータに入っていない。 / 図4.ファクターによる形態変化 高濃度(10^-7M)ファクターで34℃150分処理した後その形態を4つに分類した。PPF株については低濃度(5×10^-9M)ファクター処理時のデータも示した。 / 図5.PPF2遺伝子産物中に見いだされた7残基リビートa及びdの位置に疎水性のアミノ残基が繰り返し高頻度で現れその部位はcoiled-coil形成時の相手タンパク質との接触部になると考えられる。 / 表2.PPF2、PPF3破壊株の接合相手選択能力 / 図6.PPF3多量発現の突起形成に与える影響10^-7Mのファクターで30℃6時間処理した。(左)ベクター,(右)ベクタ-+PPF3.

　これまでにいくつかの突起形成過程に関与している遺伝子が同定されてきたが、それらはすべて他の表現形に基づいて得られ、その解析の過程を通じて突起形成に対する関与が示されてきた。本研究で私は直接形態形成異常を指針として32個もの突起形成不能株の単離に成功したが、今後新たな突起形成不能株の単離にはその親株にPPF1及びPPF3遺伝子を複数コピー持たせるなどの工夫が必要であることが今回の多数の突起形成不能株単離により明らかになった。またPPF遺伝子、特にPPF2遺伝子のクローニングの成功により、多少の困難を伴うにしても出芽酵母がこれまでの増殖に必須な過程の解析に加え先端成長過程解析のモデル系になりうることを実験的に示した。本研究をさらに進めることにより極性成長過程の一般的な機構が明らかになっていくものと期待される。PPF2及びPPF3遺伝子産物の機能について今回以下の点が明らかになった。

　(1)ファクターに対する反応性及び接合相手の選択能についての解析からPPF2及びPPF3遺伝子産物はファクター作用時に働く信号伝達系には関与していないことが示唆された。特にPPF3遺伝子産物に関してはその栄養増殖期における変異形質から極性成長そのものに関与していることが予想される。

　(2)ppf3変異株の解析から細胞質分裂、出芽位置決定、ファクター作用時の突起形成が一部共通な遺伝子産物によって担われていることが明らかになった。

　(3)PPF2,PPF3遺伝子産物はファクター作用による増殖停止からの復帰過程に関与していることが明らかになった。突起形成と適応反応が何らかの機構で結びついていることを今回初めて見いだした。