R.sphaeroidesのDMSO呼吸系の末端酵素であるDMSO reductaseの遺伝子解析を行った。生成酵素のエドマン分解で得られた内部アミノ酸配列NIEKYGMYDDに相当するオリゴヌクレオチドをクローニングのプローブとして使用し、DMSO reductaseの遺伝子を含むpstI-salI断片(3.3kbp)のDNAフラグメントを解析した。

　R.sphaeroidesのDMSO reductaseをコードする遺伝子(Rs dmsA)は2466bpからなり、DMSO reductaseはシグナル配列を含めて822残基のアミノ酸によって構成されていた。N末のシグナルペプチドは42残基からなり、matureな酵素には存在しないことがタンパク側からのアミノ酸シークエンシングと遺伝子側からの解析にによって確認された。E.coliのtrimethylamine N-oxide(TMAO)reductase(Ec torA)、biotin sulfoxide reductase(Ec bisC)、DMSO reductaseのcatalytic subunit(Ec dmsA)とのホモロジーは各々48、44、29%であった。現在までに報告されているモリブデン酵素のうち、nitrogenase以外の酵素はモリブデンコファクターを含有しており、原核生物のモリブデンコファクター含有酵素間には高度に保存された6ヶ所の配列部位が存在する。R.sphaeroidesのDMSO reductaseにもそれが存在することが遺伝子解析の結果示された。Rs dmsAのすぐ上流にもORFの存在が確認され、Rs dmsBと命名した。その産物であるRs dmsBはE.coliの未知のタンパク質tor Dとホモロジーが高かった。Rs dmsBの終止コドンとRs dmsAの開始コドンは互いに重なっており、dmsオペロンを形成していることが予想された。

　Rs dmsAの遺伝子解析から、R.sphaeroidesのDMSO reductaseはE.coliのTMAO reductase型の誘導形態、あるいは呼吸形態をとっている可能性が示唆された。そこで培養条件を光、通気、嫌気呼吸の電子受容体(DMSO、TMAO)の有無の3点に絞り、DMSO reductaseの誘導を調べた。

　E.coli torAの誘導には、TMAOの存在と嫌気条件が強く要求され、E.coli dmsAの誘導には嫌気条件のみが必要なのに対し、R.sphaeroidesのDMSO reductaseの誘導合成はこれらのどちらとも違った形態を示した。即ちDMSOの存在は強く要求されるが、嫌気条件や光は必ずしも必要でないことが分かった。TMAOによってもDMSO reductaseが誘導されたが、DMSOによるものに比べかなり低かった。

　好気的暗条件下でもDMSO添加培地(26mM DMSO)で培養するとDMSO reductaseは誘導されたが、実際に培養後のDMSOとDMSの測定を行ったところ、97%のDMSOが還元されずに残存していた。この結果により、好気的条件下では酵素の誘導は起きても電子は酸素呼吸の方向に流れている可能性が示された。

　DMSO呼吸の電子伝達系を調べるためには基質、生成物の直接検出によるアッセイ系の開発が望まれた。キャピラリー電気泳動法(CE)は、近年開発と応用がめざましい発展を遂げている分析装置である。CEによる分析は、試料導入量が数nlと極微量である、理論段数が数10万といった高分離能をもつ、操作法が簡単である、などの特徴があり、酵素のアッセイに応用するには好都合と考えられた。

　CEの分離モードの1つであるミセル導電クロマトグラフィー(MEKC)法でDMSOとDMSの分離定量を試みたところ、試料注入量6nlでDMSO、DMS共に濃度で約100M、絶対量で約50pgまで検出可能だった。本法をDMSO reductase活性測定に適用した結果、benzylviologenを用いた従来の間接的な活性測定法と遜色ない結果が得られた。DMSO呼吸の電子伝達系を解明するためのMEKC法によるアッセイ系を確立した。

　MEKC法によるアッセイ系を用いて、既知のタンパク質(R.sphaeroides cyt.c2、horse heart cyt.c、yeast cyt.b2、spinach ferredoxin)とコファクター(NADH、NADPH、FAD、FMN)を電子供与体のモデルとしてDMSO reductaseによるDMSO dependent oxidation活性を調べた。その結果、R.sphaeroidesのDMSO reductaseにはdihydro:FMN-DMSO oxidoreductase活性があることが確認された。また、R.sphaeroidesのcyt.c2はDMSO reductaseの電子供与体とならなかった。このことから、DMSO呼吸の電子伝達経路にはcyt.bcl complexが含まれていないことが推察された。

　MEKC法によるアッセイ系を使用し、R.sphaeroidesのDMSO reductase電子供与体の精製を試みた。French pressで細胞を破砕し、超遠心によって膜タンパク画分と水溶性タンパク画分に分けてDMSO reductaseによるDMSO dependent oxidation活性を調べた結果、電子供与体の活性は水溶性画分に多くみられ、さらに菌体のペリプラズム空間に存在することを確認した。

　嫌気的明条件下DMSO添加培地で培養した菌体からFrench pressによる細胞破砕液、もしくは菌体を等張液中でEDTA-lysozyme処理して得られた水溶性画分(ペリプラズム画分)を用いて、硫酸アンモニウム分画、疎水結合クロマトグラフ、ゲル濾過を経て最終的に電子供与体をSDS-PAGEでシングルバンドになるまで精製した。

　得られたタンパク質はSDS-PAGEで50kDaの分子量を示し、ICP発光分析によりFeを含有していることが確認された。Na₂S₂O₄を還元剤とし、DMSO reductaseによるDMSO dependent oxidation活性を調べた結果、同濃度のbenzyl viologenのおよそ3割であった。可視部の吸収波長には、cytochrome型のピークがみられず、Fe-Sクラスターを有するferredoxin typeのタンパクである可能性が示唆された。

　電子供与体を精製する際に、等張液中で菌をEDTA-lysozyme処理すると、Fe含量が極端に少なく、DMSO reductaseに対する電子供与活性も低い供与体が得られた。このことから電子供与体中のFeは電子伝達に直接関与しており、EDTAによってキレートされやすい形で存在することが考えられた。

　R.sphaeroidesのDMSO reductaseは微量なプロテアーゼによってnickが入り、活性が3倍ほど上昇する特徴を持つ。その部位はプロテアーゼに対して非常に敏感で、かつ活性と相関の強い部位であることがすでに本研究室で明らかにされている。DMSO reductaseと電子供与体をタンパク量比1:1で共存させてプロテアーゼ処理すると共存下では切断が起こらなくなる現象が観察された。この事実は、電子供与体がDMSO reductaseの活性と相関の高い部位に結合している可能性を示唆した。

　これまでの事実から、脱窒光合成細菌のDMSO呼吸の電子伝達系は、硝酸呼吸や酸素呼吸といった既知の呼吸とは異なった形態をとっており、cyt.bc1 complexやcyt.c2といったタンパクとは別の電子伝達体が機能していることが示唆された。