ボンビキシン-II90mgを合成し、その立体構造をNMR法により解析した。ボンビキシン-IIは中性の水や緩衝液に対する溶解性が低く、立体構造解析を行うに充分な質のNMRスペクトルを得るのが困難であった。しかし、水(70%)/酢酸(30%)(pH2.0)の溶媒条件下、4mMボンビキシン-II溶液が1か月以上安定であり、かつ、質の高いNMRスペクトルを与えたことから、この条件で2次元プロトンNMRスペクトル(DQF-COSY、TOCSY、NOESY)を測定した。pH6.8とpH2.0とでボンビキシン-IIの円二色性スペクトル(200-250nm)がほぼ一致したこと、および、pH2.0で酢酸濃度を0,10,20,30%と変化させても1次元プロトンNMRに顕著な変化が見られなかったことから、この溶媒条件のもとでもボンビキシン-IIの本来の立体構造は保たれていると見なした。なお、ヒトインスリンの場合も、水(80%)/酢酸(20%)(pH1.9)の溶媒条件下でNMRを測定し、結晶中のT-stateとよく似た構造が得られている。Wuthrichの連鎖帰属法によりボンビキシン-IIの観測されたプロトンNMRシグナルをすべて帰属した。NMR実験から得られた535個のプロトン間距離制限および二面角制限(22個、’6個)をもとに制限分子動力学計算を行い、ボンビキシン-IIの立体構造を決定した。構造にばらつきの見られたB鎖N末端領域(pGluB(-2)-HisB4)および他のペプチド鎖末端(GlyA1,CysA20,GlyB23-AspB25)を除いて、構造の収束の度合を示すroot-mean-square deviationは、主鎖3原子(N,C",C’)において0.58Å水素原子以外の全原子において1.03Åであり、精密な立体構造を決定できた(図2)。ボンビキシン-IIは脊椎動物のインスリン族ペプチドと同様のコア構造を有していたが、インスリンの生物活性発現に重要なB鎖C末端領域のターンおよびストランドが無く、かわりに、リラキシン同様、B鎖中央部のヘリックスがC末端近くまで続いていた。

図2.ボンビキシン-IIとヒトインスリン、ヒトリラキシン2の立体構造の比較

　ボンビキシンとインスリンとは40%のアミノ酸配列相同性を有するにもかかわらず互いに交差活性を有さない。このことは、各々に特有な配列が各々の受容体認識に必要であることを示している。ボンビキシン-IIの受容体認識領域を絞り込むために、ボンビキシン-IIとヒトインスリンとのキメラ分子を合成し、そのボンビキシン活性を調べた。その結果、(1)ボンビキシン-IIとヒトインスリンとの受容体認識特異性決定因子は各々のB鎖内に存在すること、(2)B鎖N末端領域(pGluB(-2)-ThrB5)とB鎖C末端領域(TrpB20-AspB25)とをインスリン型に変えても、B鎖中央領域(TyrB6-LeuB18)がボンビキシン型であれば、ボンビキシン活性が完全に保持されること、が明らかになった。こうして、ボンビキシン-II B鎖内のボンビキシン受容体認識部位を中央領域(TyrB6-LeuB18)に絞り込むことができた。次に、TyrB6-LeuB18の各アミノ酸残基側鎖の受容体認識における重要性を評価するために、各残基をAlaに置換した一連のボンビキシン-II類縁体(もともとAlaである場合には、インスリン型の残基に置換)を合成し、そのボンビキシン活性を調べた。その結果、(1)ArgB9,HisB10,ArgB13,ThrB14の各残基をAlaに置換してもボンビキシン-IIと同等の活性が保持された、(2)TyrB6,LeuB11,LeuB15,AspB17,LeuB18の各残基をAlaに置換した場合、および、AlaB12をValに、AlaB16をTyrに置換した場合には活性が低下した。これより、B鎖中央領域のTyrB6,LeuB11,AlaB12,LeuB15,AlaB16,AspB17,LeuB18がボンビキシン-IIの受容体結合に直接あるいは間接的に寄与していることが示された。他の実験から、A鎖N末端(GlyA1,ValA3)、A鎖C末端(CysA20-CysB19間のジスルフィド結合)もボンビキシン-IIの受容体結合に関与していることが示されている。

　以上のようにボンビキシン-IIの受容体認識に寄与していると特定された残基をボンビキシン-II分子上に配置した(図3)。GlyA1,ValA3,LeuB11,AlaB12,LeuB15,AlaB16およびCysA20-CysB19は、ボンビキシン-IIとヒトインスリンとの間で保存されているIleA2,TyrA19とともに、ボンビキシン-II分子表面に疎水性パッチを形成しており、このパッチ(の一部)が受容体認識部位の1つであることが示された(受容体認識部位I)。一方、TyrB6,AspB17,LeuB18はValA13,LeuA16,LeuA17の疎水性残基とともに受容体認識部位Iとは異なった分子表面にパッチを形成しており、このパッチ(の一部)もまた受容体認識部位の1つであることが示された(受容体認識部位II)。受容体認識部位IとIIとは、ボンビキシン-IIの受容体認識に寄与しないArgB9,ArgB13によって分離されている。特に、受容体認識部位I内のAlaB12,AlaB16および受容体認識部位II内のTyrB6,AspB17は、側鎖が完全に(TyrB6の場合は大部分)露出しており、インスリン型のValB12,TyrB16,LeuB6,LeuB17に個々に置換することによりボンビキシン活性が低下することから、ボンビキシン受容体の特異的認識に直接寄与していることが明らかになった。

図3.ボンビキシン-IIの受容体認識部位

　今回特定したボンビキシン-IIの受容体認識部位はヒトインスリンの受容体認識部位によく対応するが、B鎖C末端領域の役割は両者で異なる。ボンビキシン-IIの受容体認識にB鎖C末端領域(AlaB22-AspB25)は不要だが、ヒトインスリンの受容体認識にB鎖C末端領域(特にPheB24-PheB25)はきわめて重要である。このB鎖C末端領域の機能の違いは二次構造の違いに反映されており、ボンビキシン-IIのB鎖C末端領域が受容体認識部位Iの外側に位置するのに対し、ヒトインスリンのB鎖C末端領域PheB24-PheB25は受容体認識部位Iの中央近くに位置している。すなわち、ヒトインスリンは構造的にも機能的にもB鎖C末端領域を積極的に受容体認識に取り込んでいるという点でボンビキシン-IIと対照的である。ボンビキシン-IIとヒトリラキシン2とはともにArgB9,ArgB13を有しているが(ボンビキシン-IIの受容体認識部位I,IIの間に位置する)、この2つのArg残基側鎖がリラキシンの受容体認識において重要であるのに対し、ボンビキシン-IIの受容体認識には寄与しない。

　以上のように、無脊椎動物由来のインスリン族ペプチド、ボンビキシン-IIと、脊椎動物由来のインスリンやリラキシンとは共通のコア構造を有しており、ほぼ同一の面を受容体認識に用いていながら、それぞれ独自の認識部位を発達させていることが示された。