フグ毒テトロドトキシン(TTX)は最も強力な自然毒の一つで、ナトリウムチャンネルの作用を特異的に阻害する神経毒素として知られている。古来より日本人が、フグを食用としてきたことから、わが国における研究の歴史は長く、1909年に田原がこの毒をテトロドトキシンと命名して以来、既に80年以上が経過している。テトロドトキシンは1950年に結晶化に成功、1964年に構造が決定された。その後、1964年のカリフォルニアイモリの例をはじめとしてフグ以外の生物もテトロドトキシンを保有することがしだいに明らかになり、これまで8動物門26種ほどが報告されている。1986年にはこれを生産する細菌が初めて報告され、現在ではこうした細菌が海洋中に普遍的に存在し、広範囲にわたる海洋生物の毒化に関わっているのではないかと考えられている。毒の蓄積機構については、いくつかの状況証拠から食物連鎖を通じた濃縮と蓄積が示唆されているが、実際にどこで細菌によるフグ毒の生産が行われどのようにして食物連鎖に取り込まれてゆくのかは明らかになっていない。そこで、本論文では海洋細菌が増殖、集積する微小な場でありまた食物連鎖の最初に位置するものとして海水中の懸濁粒子に注目し、海洋生物の毒化に関わる最初のプロセスを明らかにすることを目的とした。

　本研究で対象とした懸濁粒子や細菌細胞の抽出物といった試料は毒性のレベルがフグなどに比べて非常に低く、従来法では十分な検出感度が得られないことも考えられた。そこで、従来の化学的分析法に加え、マウス神経芽細胞を用いたバイオアッセイ法の改良やこれまでほとんど利用されていない免疫学的手法を用いるなどしてより高感度な分析を行った。まず、懸濁粒子の中でも特に、採集の容易さ、有機物濃度の高さといった点から海水中を沈降する粒子に焦点を絞り、そこにフグ毒が存在することを明らかにした。次に、大量の試料を高感度かつ迅速に処理するために、従来のマウスアッンセイ法の代替法としてマウス神経芽細胞を用いたバイオアッセイ法の改良を行った。さらに、最近開発された抗TTXモノクローナル抗体を用いた免疫学的手法によって、細菌が生産するフグ毒について新しい角度からの検証を行った。最後に、同じく免疫学的手法を用いて、沈降粒子中のフグ毒を調べると同時に、そこに付着しているフグ毒産生細菌の直接検出を試みた。本研究の概要は、以下の通りである。

　フグ毒、テトロドトキシン(以下TTX)、は最も強力な自然毒の一つとして知られているが、フグ以外の多くの生物にもTTXが検出されることが近年明らかとなり、1986年にはこれを生産する細菌が分離された。現在ではこうした細菌が海洋に広く分布し、多くの海洋生物の毒化に関わっているのではないかと考えられるに至った。さまざまな測定結果からこの毒は、食物連鎖を通じて濃縮、蓄積が行われているのではないかと考えられているが、細菌によるフグ毒の生産がどこで行われ、どのようにして食物連鎖に取り込まれてゆくのかは明らかになっていない。そこで、本研究は海洋細菌が増殖、集積し、また食物連鎖の初期に位置する場として、懸濁粒子、特に海水中を沈降する粒子に焦点を絞り、海洋生物の毒化に関わる最初のプロセスを明らかにしようとしたものである。

　沈降粒子の採集は、神奈川県の油壷湾、さらに東京湾、相模湾、駿河湾といった沿岸域において、小型セジメントトラップを使って行った。マウス神経芽細胞を用いたバイオアッセイ(TCBA)法、HPLC蛍光分析法、GC-MS法による分析の結果、ほとんどの試料からTTXあるいはその関連化合物が検出された。一方、沈降粒子を餌としていると思われるワレカラ(甲殻類)を同時に採集し分析したところ、1個体当たり約0.1MUのTTXが検出された。本実験によって、海水中の沈降粒子にTTXが含まれることが初めて明らかになり、そのTTXが海水中でワレカラなどの小型動物に直接取り込まれたり、沈降し底棲生物に取り込まれるなどして海洋生物の毒化に大きな役割を果たしていることが示唆された。

　沈降粒子とフグ毒生産菌に関する研究をさらに進めるために、特異性や感度に優れた新しい方法として、TCBA法と抗TTXモノクローナル抗体を用いた免疫学的手法の利用を考えた。まず、これまで実用性に欠けていたTCBA法の改良を行った。テトラゾリウム塩(MTT、WST-1)の使用とマイクロプレートリーダーによる吸光度の測定によって、客観的かつ迅速な定量が可能となり、分析条件や試料中の阻害物質の影響等検討の結果、MTT-TCBA法及びWST-1-TCBA法として確立した。次に、免疫学的手法の有用性を確かめるために、これまでフグ毒生産菌として報告されている4株を含む計6株の細菌を培養し分析を行った。免疫学的手法としてマウス毒性の中和試験、酵素免疫測定法(EIA法)、加えてHPLC蛍光分析法、GC-MS法といった従来法、新たに確立したMTT-TCBA法、WST-1-TCBA法によって分析した。その結果、フグ毒生産菌の3株が、TTXではなく毒性の強い未知のTTX同族体を生産していること、またBacillus subtilisがTTXを生産することが明らかになった。免疫学的手法によってこのような新しい知見が得られその有用性が示されたが、一方でさらに詳しい解析を行うためには、TTXの生産条件や新しい生産菌のスクリーニングが必要と思われた。

　先の実験によって沈降粒子中にTTXが存在することが明らかになり、様々な状況証拠からそのTTXは付着する細菌によって生産されている可能性が高いと思われた。しかし、フグ毒生産菌の培養実験の結果から、現時点では細菌がTTXを蓄積する条件が不明であるため、粒子中の細菌を分離、培養することによってその生産能を示すのは難しいと予想された。そこで、これに代わるアプローチとして免疫染色の手法を用い粒子中の生産菌を直接検出することを試みた。TTXが検出された沈降粒子に対し抗TTXモノクローナル抗体と蛍光色素(FITC)で標識した2次抗体を用いて免疫染色を行った。蛍光顕微鏡下で観察したところ、細菌細胞様の蛍光スポットが多く見出され、DAPIとの二重染色によりそのスポットが細菌由来であることが確かめられた。この実験で、初めて細菌を分離、培養することなく沈降粒子におけるTTX生産菌の存在が示された。

　以上、新しい手法を取り入れた一連の研究によって、海水中を沈降する粒子に1MU/g前後のTTXが含まれていることが確かめられ、そこに付着する細菌にTTXが存在している直接的な証拠が得られた。このことから、デトリタス食性動物におけるTTXの存在とあわせて、沈降粒子が食物連鎖を通じたフグ毒の蓄積機構における出発点として重要な役割を果たしていることが示された。本研究のバイオアッセイ法や免疫学的手法が有効な手段となることが期待される。よって審査員一同は、本論文が博士(農学)の学位を授与するにふさわしいと判断した。