マウス由来CD4⁺タイプ2ヘルパーT細胞株であるD10.G4.1は、マウスMHCクラスIIであるI-A^kにより提示されたコナルブミンに特異性を持つが、アロ抗原であるI-A^bとも交差反応する。この性質を利用し、抗原提示細胞としてハプロタイプがkのマウスとbのマウスそれぞれの脾臓細胞を用いて内因性抗原であるアロ抗原による刺激と、外来抗原であるコナルブミンによる刺激を比較し、抗原刺激により上清に産生されたIL-4の活性をIL-4依存的に増殖する骨髄系株細胞FDC.P2の増殖を指標に測定することにより、いずれかに選択的に作用する物質の探索を行った。

　MHCクラスIIによる抗原提示を阻害すると報告のある、細胞内蛋白輸送阻害剤ブレフェルジンA、およびエンドソーム酸性化阻害剤クロロキンは、アロ抗原、外来抗原の間で特異性はなかった。このことは、これらの薬剤が両方の過程を阻害するためか、または、T細胞の活性化過程を同時に阻害しているためと思われた。調べた薬剤の中で、セリン・システインプロテアーゼの阻害剤であるアンチパインおよびロイペプチンがアロ抗原刺激を特異的に強く抑制した。ロイペプチンは、エンドソーム内でクラスIIと結合しているインバリアントチェインの分解を阻害し、抗原結合をおこせなくさせる作用が知られている。抗原提示細胞に大部分がマクロファージである脾臓接着細胞(SAC)を用いるとアロ抗原、外来抗原ともに同じ濃度で阻害された。脾臓中の主要な抗原提示細胞であるB細胞とマクロファージでは、その抗原提示の過程が異なることが示唆された。微生物1000株培養菌体抽出液について探索を行ったところ、放線菌A2669株サンプルが、アロ抗原刺激を強く阻害することが見出された。A2669株をミニジャーで6l大量培養し、菌体より70%アセトン抽出、酢酸エチル抽出、シリカゲルカラムクロマト、Sephadex LH20、シリカゲルTLCにより活性物質を精製した。¹H-NMRによる解析から、一価カチオンイオノフォアであるナイジェリシンと同定された。その作用は、エンドソームのpHを変化させることにより、インバリアントチェインの分解を阻害するものと予想される。

　ラット18日胚から調製した大脳皮質細胞をパパイン処理により分散させ、ポリエチレンイミンでコートした96穴マイクロプレートに播き、微生物培養菌体抽出物存在下1日および2日後の細胞の形態を顕微鏡観察することにより、細胞の器壁への接着および細胞の生存に影響を与えず、かつ突起伸長を抑制するものを選択した。得られたいくつかの候補についてPC12-22a細胞のNGFに依存した突起伸長に対する影響を見たところ、放線菌A3354株の菌体抽出物が、大脳皮質細胞の突起伸長を完全に抑制する濃度よりも10倍以上の高濃度においてもPC12-22a細胞の突起伸長を抑制しなかった。A3354株を大量培養し、菌体より70%アセトン抽出、酢酸エチル抽出、シリカゲルカラムクロマト、Sephadex LH20、シリカゲルTLCにより活性成分を精製した。¹H-NMRによる分析の結果、本物質はRNA合成阻害剤であるキノマイシンと同定された。PC12-22a細胞はNGFに応答した突起伸長が通常の株より早いものとしてPC12より分離された亜株であるが、NGF添加の2時間前にキノマイシンを加えても突起伸長が抑制されなかったことからRNA合成を必要としない突起伸長を行うことが示唆された。一方大脳皮質初代培養細胞はin vitroでの器壁への接着、細胞間の液性因子による活性化によりRNA合成を行うことが突起伸長に必要であると思われる。以上のことをふまえ、探索系からRNA合成阻害剤等の物質を除くため、対照としてラットグリオーマ由来株であるC6細胞の増殖に阻害を示すものを除外することにして、カビ4000株、放線菌2000株について更なる探索を行った。

　カビH16636株の菌体抽出物が大脳皮質細胞に特徴的な形態の突起を生じさせることを見出した。ポリエチレンイミンでコートしたプレートに本サンプルを前処理してもこの活性は見られなかったことから、プレートのコートにではなく、細胞に直接作用していることが示された。本サンプルの添加により通常の状態よりも細く短い突起が細胞体から放射状に伸長し、それらの突起には細胞間での連絡や突起同士での束の形成が見られなかった。神経突起の微小管構成成分であるチューブリンに対する抗体と、樹状突起に局在する微小管結合蛋白であるMAP2に対する抗体で免疫染色を行った結果、突起の先端までチューブリンは存在していたが、MAP2は細胞体にしか観察されなかった。このことから、突起の形態の異常は樹状突起へのMAP2の局在化が阻害されているためであると予想された。同じ濃度のサンプルは、C6細胞の形態および増殖に全く影響を与えなかった。H16636株を大量培養し、菌体より70%アセトン抽出、H⁺型Dowex 50W、Toyopearl HW40により1gの褐色粉末を得た。透析の結果活性成分は分子量10.000以上の高分子であったので、Sephadex G100により精製した。¹H-NMRによる解析から、活性成分は多糖であることが示された。本物質は、神経芽細胞腫株であるNeuro2A、N18、平滑筋由来株細胞であるG8-1、浮遊細胞であるミエローマ株細胞SP2ののいずれの形態にも影響を与えなかったが、分化を誘導する至適濃度である50ng/mlのNGF存在下でのPC12-22a株の突起の伸長、細胞体の肥大、接着性の増大のいずれをも促進する作用が見られた。より低濃度である5ng/mlのNGF存在下や、NGF非存在下での細胞の形態に対しては影響は見られなかった。また、同様にPC12-22a細胞に突起伸長を引き起こす100MのdbcAMP存在下での細胞の形態および突起の伸長に影響は見られなかった。

　大脳皮質神経細胞の細胞体から伸長する突起の本数を減少させ、突起の分枝を抑制する作用が見られたカビ、H19159菌体抽出液は、その100倍以上の高濃度でもC6細胞の増殖を抑制しなかったため、神経細胞に特異的な作用点を持つものと期待された。その大脳皮質細胞に対する突起の分枝抑制作用は、アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンBと類似していたが、サイトカラシンBの作用により、C6細胞は非常に特徴的な形態を示し、また増殖も強く阻害されることから明らかに両者の作用は異なるものであった。H19159株を大量培養し、菌体より70%アセトン抽出、酢酸エチル抽出、シリカゲルカラムクロマト、Sephadex LH20、シリカゲルTLCにより活性物質を精製した。本物質は、NGF50ng/mlで刺激したPC12-22a細胞の突起伸長および形態に全く影響を与えなかった。

　以上、免疫系及び神経系に作用を持つ生理活性物質の探索を行いいくつかの興味深い現象を見出した。今後活性物質の構造と作用機序の解析により細胞機能研究に新しい断面を与えることが期待される。