一般にDNA複製を阻害された細胞はM期へと進行しないが、ある種のチェックポイント変異株やカフェインにより未成熟分裂と呼ばれるM期へと進行することが知られている。DNA再複製ブロック機構というチェックポイント制御を阻害するK-252aやSTSが、未成熟分裂を誘導できるかどうかを検討した。S期に集めたCHO細胞にSTS、K-252aを添加したところ、直ちにcdc2キナーゼの活性化、染色体凝縮、紡錘体形成が起こり、未成熟分裂が誘導された。一方同様の実験を3Y1細胞で行ったところ、高度な染色体凝縮が観察されたものの未成熟分裂は誘導されなかった。この現象は電顕観察からプログラムされた細胞死として知られるアポトーシスの誘導によるものと考えられた。このときcdc2キナーゼの活性が観察されなかったことからアポトーシスでは未成熟分裂とは異なる染色体凝縮機構が存在することが示唆された。

図表

　本研究によってPK阻害剤K-252a、STSがM期を完全に欠いた細胞周期が誘導可能であること、DNA再複製ブロック機構には酵母から動物細胞まで保存されたPKが関与していることが明らかになった。特にSTSにトランスフォーム細胞に対しG1期停止活性を示さず、倍数化を誘導するという選択性が認められたことは、がん化によってG1期の制御機構およびDNA再複製ブロック機構に変化が生じることを示している。このような正常細胞とがん細胞を見分ける活性を利用して、既存の抗がん剤との併用によりin vitroでがん細胞をより選択的に殺すことができた。このような方法は今後、臨床的に重要な知見になると考えられる。

　ucm変異株を用いた遺伝学的な解析からはDNA再複製ブロック機構に関わるPKを同定するには至っていないが、その過程でK-252a感受性に関与する2つの新規遺伝子sks1⁺、sks2⁺を得ることができた。sks1⁺遺伝子産物は多コピーで多剤耐性を付与するが、今まで取得されているような多剤耐性遺伝子とは相同性がなくその耐性賦与機構には興味が持たれる。またsks2⁺遺伝子産物はHSP70familyの一つであり、薬剤耐性の一つの機構としてストレス応答を介する機構があることを示している。またpmd1⁺/bfr1⁺二重遺伝子破壊株が超感受性株であることが明らかとなったので、今後これを利用した耐性変異株の解析からのアプローチも可能となった。

　またSTS、K-252aとS期進行を阻害する薬剤を共存させることにより未成熟分裂の誘導が観察された。このことはS期とM期を互いに共役させる上でPKが重要の役割を果たしていることを示している。

　K-252aの細胞周期への作用を3Y1細胞を用いて解析した。K-252a処理細胞は一回目のS期を終了してもM期に入らず,8時間のラグの後次のS期に進行した。この8時間のラグは血清刺激が必要な機能的なG1期に相当し,M期で起こるはずの強力なCdc2キナーゼの活性化がK-252a存在下では見られなかったことから,K-252aは細胞周期のG2期の進行を阻害し,その間にG1期へ移行させることによりM期を完全に失った細胞周期を誘導し,細胞を倍数化させることが示された。倍数化は調べたかぎりすべての細胞で認められた。一方STSは3Y1の細胞周期進行をG1,G2期で可逆的に阻害するが,多くのトランスフォーム細胞ではG1期停止が起こらず,倍数化が誘導されることを見いだした。このようなSTSに対する正常細胞とトランスフォーム細胞の応答の差異を利用した新しいがんの化学療法が考えられ,実際に抗がん剤との共存によりトランスフォーム細胞の選択的な細胞死が観察された。

　分裂酵母Schizosaccharomyces pombeにK-252aを処理したところ,動物細胞と同様な倍数化が観察された。K-252aに感受性となったucm変異株を分離し,これらの変異株にK-252a耐性を賦与する新規遺伝子sks1⁺,sks2⁺が得られた。sks1⁺遺伝子はucm2,ucm3変異株に同時に耐性を賦与する遺伝子で,Caenorhabditis elegansのF37A4.5遺伝子産物と相同性を示した。また本遺伝子は生育に必須な,多剤耐性を賦与する遺伝子であった。sks2⁺遺伝子はucm1変異株に弱い耐性を賦与する遺伝子で,HSP70蛋白と高い相同性を示した。ucm1⁺遺伝子は多剤耐性遺伝子bfr1⁺と遺伝学上同一の遺伝子座にマップされ,bfr1破壊株のK-252a感受性及びucm1変位株のBrefeldin A感受性から,ucm1⁺遺伝子はbfr1⁺遺伝子と同一であると判断された。またpmd1/bfr1二重破壊株は野生株の100倍以上のK-252a感受性を示した。

　STSが未成熟分裂を誘導できるかどうかをS期に集めたCHO細胞を用いて検討したところ,直ちにCdc2キナーゼの活性化,染色体凝縮が起こり,未成熟分裂が誘導された。

　本研究によりK-252a,STSがM期を完全に欠いた細胞周期が誘導可能であり,DNA再複製ブロック機構には酵母から動物細胞まで保存されたPKが関与していることが明らかになった。特にSTSにトランスフォーム細胞に対し選択性が認められたことは,がん化によってG1期の制御機構及びDNA再複製ブロック機構に変化が生じることを示している。またucm変異株の解析で新規遺伝子sks1⁺,sks2⁺を得ることができた。sks1⁺遺伝子産物は多コピーで多剤耐性を付与するが,今まで取得されている多剤耐性遺伝子とは相同性がなくその耐性賦与機構は興味が持たれる。またsks2⁺遺伝子産物はHSP70の一つであり,薬剤耐性機構にストレス応答を介する機構があることを示している。またpmd1/bfr1二重遺伝子破壊株が超感受性株であることから,今後これを利用した耐性変異株の解析が可能である。またSTS,K-252aとS期進行を阻害する薬剤を共存させることにより未成熟分裂の誘導が観察された。このことはS期とM期を互いに共役させる上でPKが重要の役割を果たしていることを示している。

　以上,本論文は動物細胞及び真核微生物の細胞周期に研究に,K-252aやSTS等のプロテインキキナーゼ阻害剤が有用であることを示し,これを用いていくつかの新しい知見を述べており,学術上貢献するところが少なくない。よって審査員一同は,本論文が博士(農学)の学位論文に値すると認めた次第である。