A.lipoferum FSのゲノムDNA上約2.8kbのSalI断片にK.oxytocaNG13のnifA遺伝子と相同性を示す領域が存在することをサザンハイブリダイゼーション実験によって発見した。同断片をクローン化し塩基配列を決定したところ、624アミノ酸をコードするORFが見出され、同ORFの推定アミノ酸配列はK.oxytocaのNifAタンパクに対して約40%の一致を示した。

　他の窒素固定菌のNifAタンパクと一次構造を比較したところ、タンパク中央部に位置するATP binding motifを含む⁵⁴-interaction domainはA.lipoferumにおいてもアミノ酸配列上250番から450番の領域によく保存されていた。また、ヘリックスターンヘリックスタイプのDNA binding motifをふくむDNA binding domainもC末端部によく保存されていた。なお、⁵⁴-interaction domainとDNA binding domainとの間はinterdomain linker regionと呼ばれる互いに相同性を示さない領域であるが、A.lipoferumのinterdomain linkerは約140アミノ酸残基からなり、他の菌のNifAタンパクに比べて極めて長いものであった。この領域がA.lipoferumのNifAタンパクの個性を決定している可能性がある。

　次に、NifAタンパクが転写を活性化する標的であるnifH遺伝子のクローン化を行った。nifHは窒素固定反応を触媒するニトロゲナーゼのサブユニットであるジニトロゲナーゼレダクターゼをコードする遺伝子である。K.oxytocaにおいては、同遺伝子はnifHDKオペロンを構成することがすでに報告されている。

　A.lipoferum FSのゲノム上約2.7kbのSalI-HincII断片上にAzospirillum brasilenseのnifH遺伝子と相同性を示す領域の存在が示唆されたので、同断片をクローン化し、塩基配列を決定した。その結果、293アミノ酸をコードするORFが見出され、コードするアミノ酸配列はA.brasilenseのNifHタンパクのものと完全に一致した。また、この断片にはnifD遺伝子の一部(10アミノ酸分)も含まれており、nifHとオペロンを構成すると考えられる。

　A.lipoferumのnifA,nifH遺伝子の発現をノザンハイブリダイゼーション実験により解析した。50mMアンモニアを含む培地でO.D.₆₆₀＝1.0まで好気的に培養したA.lipoferumを無窒素培地に移し、微好気的(48%Air)条件で培養を続け、経時的にサンプリングを行いRNAを調製した。このRNAに対し、nifAの中央部約1kbのPstI断片、nifH中央部より下流全領域を含む約1kbのXhoI-HindIII断片をプローブとしたハイブリダイゼーションを行った。

　nifAプローブでは無窒素培地で培養を開始して30分から4時間後にかけて約2kbのバンドが観測された。しかし、アンモニアを含む培地で培養したものではバンドは観測されず、無窒素培地の場合も培養開始後6時間以上培養を続けたものではバンドの強度が低下していた。以上のことから、A.lipoferumにおいてnifA遺伝子の転写はアンモニアの存在下では抑制されており、無窒素培地において培養開始後4時間の間誘導を受けることが判明した。

　一方、nifHプローブでは無窒素培地で培養を開始してから1時間後より約6kbおよび約1kbのバンドが観測され、これらのバンドの強度は4から6時間後に最も高く、10時間後ではやや低下していた。しかし、アンモニアを含む培地、また無窒素培地でも嫌気的条件あるいは好気的条件下ではバンドは観測されなかった。この実験において観測された2本のバンドはそれぞれnifHDKオペロン全体の転写産物ならびにnifHのみの転写産物であると考えられる。以上のことから、nifH遺伝子の転写は無窒素培地でしかも微好気的条件下でのみ誘導を受け、無窒素培地での培養開始後4から6時間後に転写レベルが最も高くなることが示唆された。

　NifAタンパクの機能を、A.lipoferumのnifA遺伝子を大腸菌において発現させ、同時に導入したnifH遺伝子の転写の活性化が起こるか否かを指標に解析した。lacプロモーターの下流にnifA遺伝子を連結したプラスミドとnifHプロモーターの下流にlacZ遺伝子を連結したプラスミドを同時にlac^-の大腸菌に導入した。好気的な条件では-ガラクトシダーゼ活性は観測されず、低酸素分圧あるいは嫌気的条件でのみ活性が観測された。即ち、低酸素分圧下においてのみNifAタンパクがnifH遺伝子の転写を活性化することが示された。また、K.oxytocaのnifA遺伝子を用いて同様の実験を行ったところ、酸素分圧にかかわらずnifH遺伝子の転写の活性化が観測された。この結果はA.lipoferumとK.oxytocaのNifAタンパク間で酸素に応答した機能の差異があることを示している。A.lipoferumは低酸素分圧下でのみ窒素固定を行う細菌であり、この実験結果は同菌における酸素分圧に応じた窒素固定能発現の制御がNifAタンパクを介して行われる可能性を示唆している。

　根粒菌Rhizobium melilotiもA.lipoferum同様nifL遺伝子を持たない。同菌のNifAタンパクは、⁵⁴-interaction domainのC末端からinterdomain linkerにかけて位置する4個のシステイン残基で金属を配位しており、この部分が低酸素分圧下あるいは嫌気的条件下にのみNifAタンパクを活性型にする機能を持つことが報告されている。これらのシステイン残基はK.oxytocaのNifAタンパクには存在しないが、A.lipoferumのNifAタンパクには保存されている。このことはA.lipoferumのNifAタンパクがR.meliloti同様、それ自身がセンサーとなって酸素分圧に応じた窒素固定遺伝子群の制御を行なっている可能性を示唆する。

　本研究で、A.lipoferumのnifA遺伝子は窒素源の存在によってその転写が抑制を受け、酸素によってNifAタンパクの転写活性化能が阻害されることを示した。この窒素源ならびに酸素分圧に応答した機構は、NifLタンパクが窒素源ならびに酸素分圧に対するセンサーとしてNifAタンパクを制御しているK.oxytocaの機構と大きく異なっている。それぞれの機構の利点および欠点を解明することは、生物窒素肥料の開発のために窒素固定遺伝子群を安定に高発現させるための改良を菌に施すための重要な知見を提供するばかりでなく、窒素固定細菌の分子進化的観点からも極めて興味深い。