大腸菌のcosmid DNA library(大腸菌W3110の染色体DNAをSau3AIによって部分分解した後、cosmidベクターpHSG262を用いて作製したもの)を用い、tolZ変異株UM21に感染し、LB寒天培地で2300個のコロニーを得た。更にTolZ⁺形質転換体の出現の有無をコハク酸を唯一炭素源とする最少培地プレートで調べた。その結果、2300個のコロニーの内12個のコロニーが生育し、更にその12個のコロニーはすべてコリシンE2、E3に対し感受性であった。その12個のコロニーの内の1個から約40kbのcosmid DNAを分離した。in vitroでpackagingした40kbのcosmid DNAを用いてtolZ変異株UM21に再感染したところ、すべての形質転換体がコハク酸最小培地で生育し、コリシンE2、E3に対し感受性であった。更に40kbのcosmid DNAをPvuIIによって完全分解した後、UM21のtolZ変異を相補するcosmidベクターを含む6.2kbのプラスミドDNAを得た。次に切り縮めたDNA断片をベクターpUC118、pUC119にクローン化したプラスミドからrecA^-のtolZ変異株KM103を部分的に相補する1.8kbのBamHI断片を取ることに成功した。この1.8kbのBamHIを含むプラスミドをもつKM103はコリシンE2、E3に対して感受性であるが、温度感受性とコハク酸最小培地で生育できない性質は回復しなかった。

　1.8kbのBamHI DNA断片の全塩基配列を決めたところ、一つのopen reading frameが見つかった。蛋白質のホモロジーを検索した結果、このopen reading frameの中に酵母のSecY18などの真核細胞並びに原核細胞蛋白質のATP結合領域と相同性の高い配列が見いだされ、またこのBamHI断片の塩基配列は大腸菌ftsH遺伝子と完全に一致した。ただし、ftsH遺伝子の場合には、このBamHI断片の上流に更にopen reading frameがあること、またpUC118のLacZと1.8kb BamHI断片の中のFtsHとの融合蛋白質が生成していることがわかった。

　ftsH遺伝子は大腸菌染色体地図上69分に位置する。tolZ遺伝子は77分に位量すると報告されていたので、不一致点を明らかにするため、tolZ遺伝子のmappingを行った。まずHfr菌株を用いてのmatingの方法でtolZ変異は大腸菌染色地図上67分と73分の間に位置すること、また69分にあるargG^-、zgj-203::Tn10もつ菌株からP1ファージを調製し、P1形質導入の方法でargG、zgj-203::Tn10がtolZ変異と強くリンクすること、更に小原libiraryの69分の付近にあるcloneを利用し、tolZ変異株の相補性実験および制限酵素地図を作成した結果、520番と521番のcloneはtolZ遺伝子を含んでいることが判明した。最後に、ftsH遺伝子をもつプラスミドはKM103のtolZ変異を完全に相補することから、tolZ遺伝子はftsH遺伝子と同一のものであると結論した。

　大腸菌FtsH蛋白質は、約71kDaの細胞質膜蛋白質で、そのN端側に二ケ所の膜貫通領域とC端側には大きな細胞質領域をもち、-ラクタマーゼ前駆体のプロセシングやペニシリン結合蛋白質3の細胞質膜へのアセンブリー等に関与すること、またファージcII蛋白と転写因子³²を分解するプロテアーゼであることが明らかにされている。現在まで、tolZ変異以外にも、std(stop transfer defective)、hflB(high frequency oflysogenization)のいずれもftsH遺伝子の中に起こった変異であることが相次いで判明した。ところが、tolZ変異株はStd^-、Hfl^-の表現型を示すが、ほかのftsH変異株のいずれもtolZ変異株のようなコリシンE2,E対し耐性で、非発酵性炭素源で生育できないという表現型を示さない。これは、tolZ変異株の特別な変異部位によるものと予想された。tolZ変異株UM21からtolZ21変異遺伝子のクローニングを行い、塩基配列の決定を行った結果、亜鉛依存性プロテアーゼの金属結合残基である二つのHisおよび触媒残基であるGluからなる活性中心モチーフHEXXHの二つ目のHisがTyrに変化していた。おそらく、tolZ変異株の表現型はこのHisの変異によってプロテアーゼの機能が完全に失われたことによるものと思われる。

　親株W2252及びtolZ変異株UM21を30℃と40℃で培養し、対数増殖期、定常期の菌体をフレンチプレスで破砕し、更にsucrose密度勾配遠心法により、細胞質膜を調製した。各々について、シトクロムb、シトクロムo、シトクロムd含量を調べた。その結果、対数増殖期の40℃で、tolZ変異株のシトクロムo含量が親株に比べて少なく、更に定常期では、温度によらずシトクロムb、シトクロムo、シトクロムd含量のいずれも親株に比較して、tolZ変異株では少ないことが判明した。

　一方、これらの細胞質膜において、L-乳酸脱水素酵素、D-乳酸脱水素酵素の活性は、親株とtolZ変異株の間では大きいな相違がみられなかったが、シトクロムb₅₅₆をもつコハク酸脱水素酵素の活性は、シトクロムb、シトクロムo、シトクロムdなどの含量の相違と同様親株に比較して、tolZ変異株では少ない活性しか認められなかった。

　更に、定常期の菌体から調製した細胞質膜の極低温での酸化還元差スペクトルでは、温度によらず、tolZ変異株のシトクロムbd複合体のヘムb由来の559nmのピークが親株に比較して、著しく低くなっていることがわかった。これらの結果、tolZ変異株において、コハク酸脱水素酵素と末端酸化酵素のシトクロムの状態、あるいはヘムとサブユニットの間の結合状態が異常になっていることが示唆された。

　tolZ変異株を定常期まで40℃で培養し、菌体から細胞質膜を調製した。更に、細胞質膜を非イオン性界面活性剤sucrose monolaurateで可溶化後、シトクロムbo複合体、シトクロムbd複合体をDEAE-5PWカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーで精製した。極低温での酸化還元差スペクトルを検討した結果、シトクロムbo複合体については、tolZ変異株の563.5nmのピークが野生型株に比較して、やや低くなっていることがわかった。シトクロムbd複合体については、560nm付近のピークが、野生型株に比べてtolZ変異株では、かなりsharpになっており、また、二次微分スペクトルから559nmのピークが野生型株に比較して低くなっていることが確認された。

　以上の結果から、TolZ/FtsHタンパク質は、シトクロムbo複合体、シトクロムbd複合体、コハク酸脱水素酵素複合体のサブユニットのような膜内在性タンパク質の細胞質膜への組み込み、構造形成あるいは機能発現などに関与していることが考えられる。tolZ変異株はこのような好気的呼吸鎖電子伝達系成分に欠陥があるために、非発酵性炭素源で生育できなくなると考えられる。