ヒト線維芽細胞からソーティングして得られた染色体21番を材料として構築されたゲノミックライブラリーから効率良くチロシンキナーゼ遺伝子を単離するために、このライブラリーのDNAをテンプレートとして以下のようにPCRを行った。チロシンキナーゼにおいて保存されているサブドメインVIの配列に基づき、高度にdegenerateしたプライマー(PTK3YK)を合成した(Fig.1.)。PTK3YKの5’末端をリン酸化し、このプライマーとベクターの配列に基づくプライマー(ER)を用いてPCRを行った。増幅産物の末端を平滑化した後、テンプレートとしたゲノミックライブラリーのクローニングサイトを認議する制限酵素EcoRIで処理した。PTK3YK側が平滑末端、ER側がEcoRI切断末端となった増幅産物をディレクショナルクローニングし、得られた各クローンの塩基配列を分析することによって、チロシンキナーゼをコードするDNA断片をスクリーニングした。

　まずアニーリングの温度条件が増幅産物の泳動パターンに与える影響を検討した。増幅の特異性を決める最初の3サイクルでは比較的低温でアニーリングを行い、これに続いて厳しい条件で増幅サイクルを行った。最初の3サイクルでのアニーリング温度を50℃から5℃ずつ65℃まで変化させ、増幅産物のパターンを比較した。50℃ではl00bpから1kbにかけて多数の増幅産物のバンドが認められた。温度が上がるに従って、1kbのバンドおよび200bp付近のバンドが消失していったが、550bpのバンドは65℃でも安定であった。また、55℃まででは見られなかった400bpの増幅産物が60℃、65℃では認められた。次に、アニーリング条件が65℃のPCR増幅産物をクローン化し、その塩基配列を分析した。48クローンについてインサートDNAの長さを制限酵素処理によって調べ、4つのグループ(A、B、CおよびD)に分類し、各グループに属するクローンを2つずつ選びその塩基配列をPTK1側からのみ決定したところ、グループAに属するクローンpA1-11はプライマーの配列に用いたサブドメインVIに続いてチロシンキナーゼの保存配列を一部コードしていることが推定されたが、他の3つのグループに属するクローンからは目的とするアミノ酸モチーフのコーディングを示唆する情報は得られなかった。

　PTK3YKは高度にdegenerateしており、このために増幅の効率および特異性が悪くなっていた。そこで、より短く、中程度にdegenerateしたプライマーを新たに作製した。まず、このブライマーPTK1(Fig.1.)とベクターのアーム部分にハイブリダイズするプライマーHDを用いてゲノミックライブラリーのDNAを増幅し、次いで、この増幅産物をテンプレートとし、PTK3YKをプライマーに用いて2段階の増幅を行うsemi-nested PCRを行った。2段階目のsemi-nested primerによる増幅では、PTK1-HD増幅産物の一部が選択的に増幅されている様子が認められた。このsemi-nested PCR増幅産特をクローン化し、その塩基配列を分析した。24クローンについて調べた結果、全てのクローンが約400bpのインサートを持っていた。これら24クローンの1つであるpHA8の塩基配列を決定したところ、スプライシングの5’および3’部位のコンセンサス配列が存在し、エクソンと推定される領域がチロシンキナーゼの典型的な保存配列をコードしていることが示された。

Fig.1.Consensus sequence of protein tyrosine kinase used in derivation of PTK1 and PTK3YK oligo primers.The N represents positions where all 4 nt are present in an oligo.

　以上のように、本研究で新たに示したsemi-nested PCR法は短いアミノ酸配列を1ヶ所だけ利用して対応する遺伝子断片を単離しなければならない場合に極めて有効であり、コドンの揺らぎによるオリゴヌクレオチドのdegeneracyが高くても効率良く目的とするDNA断片を得ることができる。

　pA1-11およびpHA8について、ヒトの脳、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓の各種臓器における発現をノーザンブロットで分析した。pA1-11はいずれの臓器でも発現が認められなかったが、pHA8は脳において特異的に発現が認められた。そこで、この脳特異的な発現を示すpHA8の解析を更に進めた。

　pHA8の配列は、ヒト線維芽細胞からソーティングされた染色体21番を材料として構築されたライブラリーに由来していることから、染色体21番上にマップされることが期待されたが、染色体21番セルパネルでは染色体21番長腕上にはマップされなかった。染色体ソーティングでは5%から10%程度他の染色体が混入することが知られており、pHA8はそれらに由来していると推定された。ヒトの全染色体に対応したハイブリッドセルパネルを用いてさらにマッピングを行ったところ、pHA8は染色体9番上の配列であることが示された。

　pHA8をプローブとしてヒト脳cDNAライブラリーをスクリーニングし、cDNAクローンを単離した。塩基配列を決定し、遺伝子構造を鱗析した結果、pHA8に見られたサブドメインVI-VIIIに加え、チロシンキナーゼの残りの全てのサブドメインがC末端側に認められたことから、この遺伝子がチロシンキナーゼをコードしていることが示された。また、膜貫通ドメインと推定される疎水性領域がキナーゼドメインのN末端側に存在しており、リセプター型であることも示された。この脳に特異的なリセプター型チロシンキナーゼ遺伝子をbyk(brain-specific tyrosine kinase)と命名した。

　cDNA塩基配列より予想されるアミノ酸配列に基づいて合成したペブチドをラテックス粒子に結合させて抗原とし、ウサギを免疫してポリクローナル抗体を得た。Bykの脳における発現を免疫組織染色によって解析した結果、パラフォルムアルデヒド固定したヒト脳サンプルにおいて、大脳皮質III層の錐体細胞、海馬CA2、CA3、CA4野の錐体細胞、および海馬歯状回の顆粒細胞において染色が顕著に認められ、これらのニューロンで特異的にbykが発現していることが示された。海馬CA1野では染色がほとんど認められず、ニューロンの機能の特異性とbykの発現とが関連している可能性も示唆された。ヒトのパラフォルムアルデヒド固定サンプルは徴細構造が破壊されており、細胞内の局在性などの解析には不向きである。そこで、ラット脳サンプルを用いて免疫組織染色を行った結果、Bykが錐体細胞、顆粒細胞といったニューロンの核膜に局在していることが示された。また、グリア細胞のtuber形成が脳内に特徴的に見られる結節性硬化症(tuberous sclerosis,TSC)患者の脳切片を用いて同様の解析を行ったところ、病変部において顕著な染色が認められた。正常組織ではニューロンで発現するBykがtuberを形成したグリアで認められたことは、TSCにおけるbykの発現異常が病変のメカニズムに関連していることを示唆しており、極めて興味深い。

　以上のように、本研究において同定されたBykはニューロンで特異的に発現するリセプター型チロシンキナーゼであり、海馬や大脳皮質における高度な情報処理に関与する可能性が高い分子として注目すべきものである。また、TSCの脳tuberにおけるBykの異常発現を解析することによって、難病であるTSCの病変メカニズム解明の手掛かりが得られることも期待される。