まず,マウスIP3RcDNA配列のうち、推定開始コドンを含む380bをプローブとして、129系マウスES細胞由来染色体DNAより作成したゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、11個のマウスIP3R遺伝子ファージクローンを得た。次に、これらのクローンを、推定開始コドンを含むオリゴヌクレオチド・プローブaを用いてスクリーニングすることにより、推定開始コドンを含む染色体DNAクローン(A1b)を単離した。このA1bDNAの、制限酵素(EcoRl,Xbal,Sall)等による切断パターンにより、マウスIP3R遺伝子開始コドン領域の制限酵素地図を作成した(全長13.7kb)。オリゴヌクレオチド・プローブaを用いたサザン法の結果より、開始コドンの存在領域を同定し、この周辺の塩基配列を決定したところ、同部位を含むエキソンは,cDNA配列313番から420番の108baseに相当し、この上流に少なくとも2つのnon-coding exonが存在することが判明した。また、転写開始部位を含むエキソン1特異的オリゴヌクレオチド・プローブbによる検索の結果、A1bは,同エキソンを含まないことが示された。さらに、cDNA中で、このエキソンのすぐ下流のエキソン配列に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブcによる検索から、同エキソンは、A1b中で開始コドンを含むエキソンより4.4kb下流に位置し、cDNA配列421番から491番の71baseの配列に相当することが明らかとなった。

　ターゲティング・ベクターの型としては、導入したい変異の両側に相同遺伝子部を付加し、5’側及び3’側の二カ所での組み換えの結果、変異遺伝子が正常遺伝子と置換されることを期待する「置換型」を採用した。ターゲティング・ベクターAは、5’(2.0kb)側、3’(8.0kb)側いずれの相同領域とも、A1bよりその配列を得た。優性選択マーカーとしては、ネオマイシン遺伝子を用い、推定開始コドン直下(15塩基)のEcoRl部位にネオマイシン遺伝子が挿入される結果、IP3R遺伝子のオープン・リーディング・フレームがそこで中断されてしまい、機能を有する産物が産生されなくなることを期待した。また、相同組み換え体を濃縮して得るための、カウンターセレクション・マーカーには、HSV-TK ; Herpes simplex virus-thymidine kinaseを採用し、これを、5’相同領域の外側に連結した。ES細胞への導入の際には、ターゲティング・ベクターを直鎖状にすることが必要であるが、このための切断部位としては、3’相同領域の3’端に存在するXhol(pBluescript II KS-のmulti-cloning site)を選んだ。

　1と同じゲノムライブラリーに対して、Alb5’端に存在するプローブ11.0kbを用いて新たに得られた1クローン(13C)の解析から、このクローンは、A1bの上流4.7kbに始まりA1bの一部10.4kbに重なる、全長15.1kbであることが判明した。ターゲティング・ベクターBは、Aと同じ「置換型」ベクターであるが、、5’相同領域(7.6kb)が3’相同領域(1.2kb)より長く、前者の大部分の配列を13Cより得ている点が異なっている。(後者及び、優性選択マーカー前後の配列は、ターゲティング・ベクターAと全く同じ。)また、カウンターセレクション・マーカーには、DT-A ; Diphteria toxin A fragmentを採用し、これを、3’相同領域の外側に連結した。最後に、DNAを直鎖状にするための切断部位としては、5’相同領域5’端に存在するNotl(pBluescript II KS-のmulti-cloning site)を選んだ。

　ES細胞は、J1株(M.I.T.,R.Jaenisch研究室由来)を使用した。電気穿孔法は、30g DNA/2×10⁷cells/1cubettについて、20F,400Vの条件下(BioRad Gene-Pulser使用)で行なった。培養、薬剤選択(G418及び、ターゲティング・ベクターAのみFIAU使用)、コロニー採取、細胞凍結、DNA抽出等は、全て常法に従った。

　ES細胞より抽出したDNAを、全てEcoRIで消化し、サザン法によるスクリーニングを行った。ターゲティング・ベクターAでは、プローブl1.0kb(5’flanking領域)を、Bでは、プローブII0.7kb(3’flanking領域)を使用した。これにより、目的通り相同組み換えが起きた場合、野生型の5.3kbpのバンドに加え、3.2kbpのバンド(Aの場合)、あるいは3.6kbpのバンド(Bの場合)が、1対1の比率で現れるはずであるが、実際に期待通りのバンドパターンが得られたのは、Bの1クローン(No.162)のみであった(相同組み換え体/採取コロニー数は、A...0/764,B...1/567)。次に、No.162について、ブローブI(internal probe)を用いて、同様にEco RI消化でサザン法を行なうと、予想通りのバンドパターン(5.3kbp-3.2kbp)が得られ、5’側方向へ、ターゲティング・ベクターが連結して挿入される等の、異常がおきている可能性は、否定された。さらに、Neoブローブ(ネオマイシン遺伝子PstI-PstI670b)を用いて、同様にサザン法を行うと、予想通り3.6kbpバンドが得られ、ターゲティング・ベクターの2コピー挿入等の異常がおきている可能性は、否定された。以上より、このクローンは、目的通りの相同組み換え体であると判断された。

　自然交配させたC57BL/6より得たブラストシスト31個に対し、No.162ES細胞各12-15個をマイクロインジェクションし、計11匹のキメラマウスを得た。これらは全て雄であり、キメリズムの指標である雄性性転換が有意に認められたので、このうちさらに、毛色判定によるキメリズムの高い6匹(いずれも129系由来アグチ色が70-95%)を、F1マウス作製用に使用した。

　上記6匹のキメラマウスを、各2匹のC57BL/6(雌)に交配させた結果、6匹×2匹＝計12腹より得られたF1のほぼ全て(78匹/79匹)が、ES細胞由来のアグチ色であった。次に、各個体の尾部より抽出したDNAを鋳型とし、開始コドンを含むエキソン直前のイントロン配列、Neoカセットpgk-1プロモーター内の配列をそれぞれ、5’-,3’-プライマーとしてPCR増幅を行ったところ、予想通り、約半数に当たる40匹(雄20匹、雌20匹)で、mutant alleleの指標である177bpのバンドが検出され、キメラマウスにおけるgermline transmissionが確認された。冒頭の様に1型IP3受容体は、個体内では、小脳プルキンエ細胞において、最も多く発現していることが知られている。従って、今回の変異導入により、もし期待通り蛋白が産生されなくなるとすると、1型IP3受容体の発現量が半分になったヘテロマウスが、小脳症状等を示す可能性は、考えられる。しかし、その様な、行動異常は、観察されなかった。また、同受容体は、初期形態形成に関与することが推測されているため、ヘテロマウスの出生率、体格等に影響を及ぼす可能性も考えられるが、その様な変化は、やはり観察されなかった。今後、ヘテロマウスどうしの兄妹交配により、F2ホモ個体、すなわち1型IP3受容体を、完全に欠損したマウスが得られれば、当初期待した通り、同受容体の個体レベルにおける機能を検索する上で、有用となり得ると考えられる。