我々の研究室では幼虫期の神経芽細胞でlacZの発現が見られるエンハンサートラップ系統Fz13(第二染色体上にP因子挿入変異を持つ)が得られている。そこで我々はこのFz13系統でのlacZの発現を指標として、幼虫期神経発生に異常を持つ突然変異のスクリーニングを行おうと考えた。すなわち、まず、P因子を用いて突然変異を作成する。次に、交配によって、Fz13由来のP因子を第二染色体上に持ち、第三染色体上に作成したP因子挿入変異を持つような系統、A系統を作成する(図参照)。そして、それぞれの系統から生まれた個体の三令幼虫期中枢神経系をXgal染色することにより、lacZの発現パターンに異常を示す系統をスクリーニングした。

図.A系統の遺伝子型

　こうして約700系統を調べた結果、我々は幼虫期-蛹期致死突然変異A9-Fz13系統を得ることができた。この系統ではFz13ヘテロ/A9ホモ接合体で幼虫期の脳が非常に小さく、脳でlacZの発現する細胞が顕著に減少している。腹部神経節では、神経芽細胞がほとんど見られない腹部神経分節で、lacZの発現する細胞の分布が見られる。一方、神経系以外の組織ではこのような顕著な異常は観察されない。蛹後期まで発生が進んだ個体は外形的には顕著な異常が観察されないが、成虫型の脳形成が見られず、特に、optic lobeが全く観察されない。我々はこのような表現型から、新たなP因子の挿入を受けた遺伝子座を今後no optic lobes(nol)遺伝子座と呼ぶことにした。

　我々は、nolにおける幼虫期神経芽細胞の異常をより詳しく解析するため、BrdU(チミヂンのアナログ 増殖中の細胞とその娘細胞を標識できる)を用いた解析を行うことにした。

　ショウジョウバエの神経芽細胞のほとんどのものは胚期に増殖を行った後、一旦増殖を停止し、一令幼虫期から二令幼虫期に再度分化し増殖を再開する。例外的に脳の左右5対の神経芽細胞は胚期から幼虫期にかけて増殖を継続していることが知られる。

　孵化直後の幼虫では、顕著な異常は観察されず、nolでも5対の神経芽細胞がほぼ正常に増殖していることが明らかとなった。。ところが、幼虫期神経芽細胞の再分化が始まる一令幼虫中期以降になっても、nolでは再分化が全く起きていないことがわかった。さらに、二令幼虫期以降になると、位置的に神経芽細胞ではないと考えられる細胞でBrdUの取り込みが見られ、これらの細胞はほとんど分裂をせずにDNA合成のみを繰り返していることが示唆された。また、nolで増殖を続けていた5対の神経芽細胞も二令幼虫期までは分裂を続けるが三令幼虫期には分裂を停止していた。なお、胚期には顕著な異常が観察されなかった。

　以上の結果から、nolでは幼虫期神経芽細胞の分化が起こらず幼虫期にほとんど神経芽細胞が産生されないこと、また、本来DNA合成を行わない神経芽細胞以外の細胞でDNA合成が行われていることから、これらの細胞の分化にも異常をきたすことが明らかとなった。

　nol遺伝子産物の機能を分子生物学的に明らかにするため、我々はこの遺伝子のクローニングを試みた。

　まず、P因子をプローブとしてゲノムDNAクローンをスクリーニングし、これをもとにP因子挿入位置近傍の分子生物学的地図を作成した。次に、この領域のゲノムDNAをプローブとしてノーザンブロッテイングを行い、この領域から幼虫期に転写される3つの転写単位、transcript A、B、Cを同定することができた。さらに野生型、nolホモ接合体のmRNAを用いたノーザンブットを行った結果、transcript Aだけはnolホモ接合体で発現量の顕著が減少していることが明らかとなった。

　このことから、transcriptAがnolであることが示唆されたため、これをプローブとしてcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。さらに得られたクローンをもとにtranscript Aの塩基配列を決定し、これからtranscript Aの遺伝子産物を推定した。この結果transcript Aは約650bpの塩基からなり、シグナルペプチドを持つ130アミノ酸のポリペプチドを翻訳していると推定された。また、このアミノ酸配列中にはセリン、トレオニン、プロリンからなる繰り返し配列が見られ(ムチン様領域)、この領域に多数の0-結合型の糖鎖が結合していると推定された。また、このtranscript Aをプローブとしてin situハイブリダイゼーションを行ったところ、この転写単位は中枢神経系、成虫原基、唾腺など様々な組織で発現していることが明らかとなった。

　nolでは幼虫期に再分化するはずの神経芽細胞で増殖が始まらず、一方で胚期から増殖を続けている神経芽細胞は、二令幼虫期までは分裂を継続していることが明らかとなった。このことから、nolの遺伝子産物はcyclin、cdcキナーゼのような細胞増殖に直接関与する分子というよりも、むしろ、神経芽細胞の分化に関与する分子であると考えられる。

　一方で、胚期から増殖を続けている神経芽細胞も三令幼虫期までに増殖を停止してしまう。このことから、nolは神経芽細胞の増殖維持にも必要であると考えられる。

　nolでは神経芽細胞で増殖が行われていない一方で、神経芽細胞以外の細胞で、すなわち神経、グリア細胞でDNA合成が行われていることが示唆された。このことから、nolはこれらの細胞の分化維持にも必要であるものと考えられる。

　ノーザンブロットの結果から、少なくともtranscript A、B、Cの中ではtranscript Aがnolである可能性が高いことが示唆された。また、塩基配列から、この転写単位からはムチン様の領域を持つ分泌性のタンパク質が翻訳されると推定された。

　ムチン様領域は、o-結合型の糖鎖が多数結合している領域であり、癌化した細胞から分泌されるある種の糖タンパク質中に見られることが良く知られている。この様な糖タンパク質の過剰な発現は細胞接着や細胞間隙での分子間相互作用を阻害するものと考えられている。このことから、transcript A産物も細胞接着や分子間相互作用に関与していることが推測される。これはnol突然変異の表現型、すなわち中枢神経系細胞の分化異常を良く説明しており、transcript Aはnol遺伝子であると考えられる。