平田らにより、インスリン自己免疫症候群(IAS)が初めて報告されたのは1970年であり、診断基準としては、以下の3つの項目が挙げられる。(1)自発性低血糖を主症状とする。(2)インスリン投与の既往がない。(3)低血糖発作時の血清から大量の抗インスリン抗体が検出されるが、同時にインスリンと抗インスリン抗体の結合した免疫複合物も大量に血中に認められる。

　現在まで約200例の報告例が存在するが、日本での報告が圧倒的に多かった。最近、内潟らはほぼ100%のIAS患者において、HLA-DRB1^*0406,DQA1^*0301,DQB1^*0302という特異的なアリールを有することを確認した(odds ratio 281,p<10^-10)。HLA-DRB1^*0406、DQA1^*0301、DQB1^*0302は専ら黄色人種に認められるクラスIIアリールであった故に疾患の発症頻度に人種差が生じたものと考えられた。

　内潟らはIAS患者から末梢血リンパ球を採取し、インスリン存在下で増殖する現象を確認後、この特異的なクラス遺伝子由来の分子が、IASの発症に深く関与していることが推測されたため、このクラスIIアリールが、ヒトインスリンの抗原提示とT細胞による認識に関与するか否かについて、自己のリンパ球混合反応の系を用いて確認することにした。

結果

　患者のみならず、種々HLAタイプを有する健常人由来のリンパ球混合反応の系にヒトインスリンを加え、その抗原刺激により、リンパ球が増殖するか否かを、観察した。その結果、患者、健常人にかかわらず、HLA-DRB1^*0406,DQA1^*0301,DQB1^*0302を有するリンパ球は、ヒトインスリンに対して特異的に増殖反応を示し(表1)、それ以外のタイプでは反応を示さなかった。この反応は、抗HLA-DR抗体によって阻害され、抗HLA-DQ抗体や抗クラスI抗体によっては影響されなかった(図1)。さらに、特異的なHLA-DRB1^*0406,DQA1^*0301,DQB1^*0302アリールを持つ健常人2名の末梢血リンパ球より、インスリンに特異的なT細胞株を樹立した。T細胞クローンはいずれもCD4+,TCR/+であった。このクローンに対し、HLA-DRB1^*0406遺伝子をトランスフェクトしたL細胞を抗原提示細胞として用いて、インスリンに対する特異性を確認した(本論旨内、表5)。また、患者と健常人のいずれにおいてもヒトインスリンA鎖8-17番またはヒトインスリンA鎖8-21番とヒトインスリンB鎖11-30番の3種に対し、ヒトインスリンであらかじめ刺激を受けたリンパ芽球は増殖を示したが、ヒトインスリンA鎖1-10番とヒトインスリンB鎖1-18番の親和性を持たないペプタイドには反応しなかった。HLA-DR分子に対する親和性とリンパ球の反応性がほぼ一致した。

表1;HLA-DRB1*0406を持つTリンパ球のインスリンに対する増殖反応について^aa 5×10⁴個の放射線照射ずみの末梢血リンパ球を抗原提示細胞(APC)として、40Mのヒトインスリン(HI)とともに18時間37℃でインキュベーションした。そして、5×10⁴個の同じドナー由来のTリンパ球(R)を加え、6日間培養した。結果は3つのデータの平均値を表示した。標準偏差は平均値の15%以内であった。 APCのみ、APCとHI、RとHIのトリチウムチミジンの取り込み量は各々、554±103、886±130、1608±210(JJ)であった。^bS.I(Stimulation Index;R+APC+HI/R+APC)は3より大なるものを陽性として評価した。表5;HLA-DRB1^*0406をトランスフェクトされたL細胞はDTT存在下で、T細胞クローン細胞にヒトインスリンを提示する^aa L細胞トランスフェクタント(LDR)とトランスフェクトしていないL細胞(L-non)を40Mのヒトインスリン(HI)、2mMのDTTとともにインキュベーションし、80Gyの放射線の照射を行った。その後、5×10₄個のT細胞クローン細胞(C)を加え、2日間培養した。トリチウムチミジンの取り込み量は各々、以下のとおりである。LDRのみ、5003±1066、Lnonのみ、4190±232。各々のT細胞クローン細胞のみ、T108 171±9、H120 1045±5、H122 3142±8、H141 242±41、H142 172±42。

　本研究はインスリン自己免疫症候群(IAS)の病因に関連して、HLA-DRB1^*0406由来の分子がヒトインスリンの抗原の提示に関して有意な拘束性を示すことを細胞の機能の点から証明するものであり、下記の結果を得ている。

　1.HLA-DRB1^*0406を持つTリンパ球のインスリンに対する増殖反応について我々は、はじめにDRB1^*0406ハプロタイプを有するリンパ球がインスリンに対する増殖に関係しているかどうかを確認するためヒトインスリンの存在下で自己リンパ球混合反応によりリンパ球の増殖を検討した。DRB1^*0406を有する11人のIAS患者、DRB1^*0406を有する10人の健常人とDRB1^*0405を有する5人の健常人由来のサンプルを用いた。40Mのヒトインスリンの刺激によりDRB1^*0406を有するリンパ球は、増殖反応を示したが、DRB1^*0405を有するリンパ球は、取り込み量は上昇しなかった。尚、DRB1^*0406を有する11人のIAS患者と10人の健常人との間に反応性の違いは認められなかった。

　2.HLA-DR4以外のHLAクラスIIを有するサンプル12人について同様の自己リンパ球混合反応を行なった。その結果、HLA-DR4以外のクラスII抗原を持つリンパ球はヒトインスリンの存在下で増殖を認めなかった。よって、1および2より、ヒトインスリンはDRB1^*0406又はDQA1^*0301、DQB1^*0302の遺伝子産物によって提示されることが確認された。

　3.2人の健常人のサンプルを用いて1および2と同じ系において精製モノクローナル抗体である抗HLAクラスI抗体、抗HLAクラスII抗体を加え、増殖反応に対する影響を見た。抗HLA-DR抗体を加えたところ、増殖に対する強い阻害が生じたが、抗HLA-A,B,C抗体と抗HLA-DQ抗体、マウスIgG1、マウスIgG2aを同濃度で加えても変化は認めなかった。よって、DR遺伝子由来の分子がヒトインスリンの抗原提示に関与していることが判明した。

　4.L細胞トランスフェクタントを抗原提示細胞として用いて実験を行った。DRB1^*0406を有するIAS患者および健常人から得られたTリンパ球に対してHLA-DRB1^*0406遺伝子のトランスフェクタントは、DTT存在下でヒトインスリンを提示することができた。

　5.DTTの効果を観察するために固定したL細胞を抗原提示細胞として用いた。固定したL細胞をヒトインスリンでインキュベーションする時、DTTを含む系と、DTTを含まない系で、メチルチミジンの取り込み量を比較した。その結果、DTT存在下の方がDTTなしよりもヒトインスリンに対する反応性が高かった。DTTが、1つもしくは2つのS-S結合を還元し、生じたペプタイドが直接、細胞表面のHLAクラスII分子に結合する可能性が想定された。IASが還元剤の投与によって誘導される可能性が過去に発表されたが、in vitroでの証明となるものと考えられる。

　6.HLA-DRB1^*0406を有する2人の健常人のリンパ芽球から限界希釈を用いてヒトインスリンの存在下で5つのT細胞クローンを樹立した。これらのT細胞クローンはすべてCD4+、TCR/+のT細胞であった。5つのT細胞クローンは、DRB1^*0406を有する抗原提示細胞に対してインスリン存在下で増殖した。

　7.ヒトインスリン由来の合成ペプタイドをリンパ球混合培養の系に加えて反応性の有無を確認した。患者と健常人のいずれにおいてもヒトインスリンA鎖8-17番またはヒトインスリンA鎖8-21番とヒトインスリンB鎖11-30番の3種に対し、ヒトインスリンであらかじめ刺激を受けたリンパ芽球は増殖を示したが、ヒトインスリンA鎖1-10番とヒトインスリンB鎖1-18番の親和性を持たないペプタイドには反応しなかった。HLA-DR分子に対する親和性とリンパ球の反応性がほぼ一致した。さらに、ヒトインスリン内に複数のT細胞エピトープが存在する可能性が考えられた。

　以上、本論文は、ヒトインスリンの抗原提示とT細胞による認識において、HLA-DRB1^*0406由来のHLA分子が、有意な拘束性を示すことを証明した。よって、自己免疫疾患であるインスリン自己免疫症候群の病因にHLA-DRB1^*0406が特異的に関与している点が機能的に立証された。今後、自己抗原の出現の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと思われる。