肝臓は、血糖の恒常性を維持していく上で非常に重要な臓器である。肝臓のグリコーゲン代謝は様々な神経やホルモンの支配によって複雑に制御されている。

　1982年、岡島、宇井は、ラット肝細胞を初代培養するとNorepinephrine刺激によるGlycogen Phosphorylase(Phosphorylase)活性化の受容体依存性が₁受容体から₂受容体へと機能転換することを見出し、これを「→転換」と称して報告した。この現象は動物の生体内においても、肝臓の外科的、化学的な損傷時に発現することが知られている。

　また、梶山らは、この「→転換」が、分離した肝細胞の初代培養において低細胞密度培養時にのみ発現してくることを見出した。また、この培養時に肝細胞の膜画分を添加することによって「→転換」の発現が抑制されるという知見を得た。さらに、膜画分の添加によるこの現象の発現抑制と、肝細胞のDNA合成の抑制に相関性があることから、「→転換」は細胞増殖期への移行(G0/G1→S)に伴う現象であることを示した。

　本研究では、肝細胞の「→転換」に伴って起こる膜レベル以降の細胞内情報伝達系の変化、特に細胞内Ca²⁺動員系の変化について解析を行なった。

　まず、肝細胞のホルモン刺激における最終応答と考えられるPhosphorylaseの活性化について検討を行なった。Phosphorylaseは、肝臓のグリコーゲン分解によるグルコース産生に非常に重要な酵素であり、Phosphorylase Kinaseによるリン酸化によって活性化されることが知られている。この酵素活性はcAMPとCa²⁺の両方で制御されており、これら二つのセカンドメッセンジャーの細胞内濃度上昇により活性化される。ラット遊離肝細胞を高細胞密度(1.6×10⁵cells/cm²)と低細胞密度(2×10⁴cells/cm²)で初代培養し、各培養時間において受容体刺激によるIP₃生成とPhosphorylaseの活性化について調べた。高細胞密度培養においては、培養時間の経過と共に受容体刺激によるIP₃生成が変化することはなかった。これに対し、低細胞密度培養時には培養時間の経過に伴って比較的ゆっくりと減少していくことが観察された。また、PhosphorylaseのCa²⁺動員性のホルモン刺激による活性化は、「→転換」に伴い低細胞密度培養時にのみ急速に減少していくことが観察された。この受容体刺激によるIP₃生成とPhosphorylaseの活性化は、同じ受容体刺激を行なっているにも関わらず、培養による減少の時間経過が異なっていた。つまり、「→転換」に伴う受容体刺激によるIP₃生成の減少がほとんど観察されない培養時間において、同じ刺激によるPhosphorylaseの活性化は遊離肝細胞の70%近くまで減少していることが示された。

　このIP₃生成とPhosphorylase活性化の時間的な相違はどのレベルで起こっているかということについて、以降検討を行なった。前にも述べたように、Phosphorylaseの活性化を行なうPhosphorylase KinaseはcAMPとCa²⁺の細胞内濃度上昇によって活性化されることが知られているので、細胞内からのCa²⁺動員系が「→転換」に伴って変化していることが想定された。また、細胞を破砕した実験の結果から、Phosphorylaseはホルモン刺激により細胞内ストアから動員されたCa²⁺によって大部分が活性化されることが示唆された。そこで、細胞外液にCa²⁺を含まない状態で受容体刺激を行ない、細胞内ストアからのCa²⁺動員を各培養時間経過した細胞で観察した。高細胞密度培養では、培養時間の経過に伴って受容体刺激による細胞内からのCa²⁺動員が変化することはなかった。これに対し、低細胞密度培養時には、培養時間の経過に伴い受容体刺激による細胞内からのCa²⁺動員は急速に減少していくことが観察された。この受容体刺激による細胞内からのCa²⁺動員の「→転換」に伴う減少は、同じ刺激によるPhosphorylase活性化減少の時間経過と一致していることが示された。

　このことから、「→転換」に伴い、小胞体中のIP₃感受性Ca²⁺ストアに何らかの変化が起こっている可能性が考えられた。そこで、肝細胞の小胞体を含む画分においても、同様の現象が観察されるかどうか検討を行なった。遊離肝細胞を低密度と高密度で初代培養した後ホモジェネート(20000×g遠心操作後の上清)を調製し、この画分に含まれる小胞体のCa²⁺ストアからのIP₃感受性Ca²⁺放出の測定を膜透過性のないFura-2を用いて行なった。高密度培養の細胞から調製した画分からのIP₃添加によるCa²⁺放出は培養時間の経過に伴って変化することはなかったが、低密度培養の細胞から調製した画分でのCa²⁺放出では、IP₃の濃度依存性が高濃度側に移行しており、またIP₃の添加によるCa²⁺放出能も低下していることが観察された。さらに、この画分に対するIP₃の結合活性を測定したところ、高細胞密度で培養を行なった場合にはIP₃に対する親和性や結合部位数が変化することはなかったが、低細胞密度で培養を行なった場合にのみ、培養時間の経過に伴って急速に結合部位数が減少していくことが示された。この結果から、「→転換」の初期に観察される受容体刺激によるIP₃生成と細胞内からのCa²⁺動員の時間的なずれは、IP₃結合部位の減少を伴う、IP₃感受性Ca²⁺プールからのIP₃に応答したCa²⁺放出の減少に起因することが示された。

　様々な細胞の機能に重要な役割を果たす細胞内Ca²⁺濃度上昇は、細胞内からの動員ばかりではなく、細胞外からの流入によっても引き起こされる。そこで、受容体刺激による細胞外からのCa²⁺流入を、「Ca²⁺の後添加法」を用いることにより細胞内からの動員と分離して測定し、細胞外からのCa²⁺流入が「→転換」に伴ってどのように変化するかについても検討を行なった。高細胞密度培養時には細胞外からのCa²⁺流入が培養時間の経過と共に変化することはなかった。これに対して、低細胞密度培養時には、細胞外からのCa²⁺流入が培養時間の経過と共に減少していくことが観察された。しかし、この減少は、Phosphorylase活性化の「→転換」に伴う減少の時間経過と異なり、むしろ受容体刺激によるIP₃生成の減少の時間経過と類似していた。また、受容体作動性のCa²⁺流入(Receptor-operated Ca²⁺influx)とは独立したCa²⁺流入経路として想定されている貯蔵部位直結性のCa²⁺流入(CapacitativeCa²⁺influx)は肝細胞ではほとんど観察されず、また「→転換」に伴う変化も観察されなかった。このことから、細胞外からのCa²⁺流入の「→転換」に伴う減少は、膜上の受容体数の「→転換」に伴う減少と相関していることが考えられた。また初代培養肝細胞においては、細胞外からのCa²⁺流入は細胞内のCa²⁺プールが枯渇したことによって起こる二次的なものではなく、細胞内からのCa²⁺動員とは独立したCa²⁺動員経路である可能性が考えられた。

　また、新たに肝細胞の小胞体を含む画分において、Cyclic ADP-ribose(cADPr)の添加によりCa²⁺放出が起こることを見出した。このCa²⁺放出はcADPrに特異的であり、他の類似した化合物ではCa²⁺放出が起こらなかった。またHeparinの添加効果から、cADPrはIP₃感受性のCa²⁺ストアとは独立した別のストアからCa²⁺を放出させることが示された。ただし、このストアはRyanodine感受性のストアではない可能性が考えられた。また、cADPrの添加によるこのストアからのCa²⁺放出は、肝細胞の「→転換」に伴って変化することはなかった。さらに、cADPrがホルモン刺激によって生理的にCa²⁺放出を起こすメッセンジャーである可能性を考え、様々なホルモン刺激による細胞内のcADPr濃度変化について検討を行なったが、刺激による有意な濃度上昇は観察されなかった。

　これらのことから、肝細胞の「→転換」に伴って、ホルモン刺激によるIP₃生成の培養時間に伴う減少に先行して、同じ刺激による細胞内ストアからのCa²⁺動員が減少していることが示された。これは、小胞体上のIP₃結合部位の減少を伴った、IP₃感受性Ca²⁺ストアからのCa²⁺放出が減少することに起因すると結論づけられた。また、肝細胞にcADPr感受性のCa²⁺ストアが存在することが示された。

　肝臓におけるグリコーゲン代謝は血糖の恒常性の維持に重要な役割を果たしているが、ラット肝細胞の初代培養においては、グリコーゲン分解に関わるアドレナリン受容体のサブタイプがから型へと変換することが報告されている。肝細胞の増殖期への移行と関連するこのアドレナリン受容体の「→転換」は、肝細胞を低密度で培養した時にのみ観察される。"ラット初代培養肝細胞における「→転換」に伴う細胞内カルシウムの変化"と題した本論文は、肝細胞の「→転換」に伴って発現する細胞内情報伝達系の変化、特に細胞内Ca²⁺動員系の変化を解析している。

「→転換」に伴うIP₃産生応答の減弱

　肝グリコーゲン分解によるグルコース産生に重要な酵素であるphosphorylaseは、phosphorylase kinaseによるリン酸化によって活性化されるが、この酵素はcAMPとCa²⁺を動員するIP₃の二つのセカンドメッセンジャーで制御されている。ラット遊離肝細胞を低細胞密度で初代培養し、各培養時間において受容体刺激によるIP₃生成とphosphorylaseの活性化を解析した結果、時間経過と共にCa²⁺動員性のホルモン受容体刺激によるIP₃生成が比較的ゆっくりと減少するのに比べて、phosphorylaseの活性化は急速に減少することが示された。すなわち、受容体刺激によるIP₃生成とphosphorylaseの活性化は、同じ受容体刺激にも関わらず、初代培養による減少の時間経過が異なることが明らかにされた。一方、高細胞密度培養時にはこのような変動は認められなかった。

「→転換」に伴うIP₃感受性Ca²⁺ストアの変化

　「→転換」に伴うIP₃生成とphosphorylase活性化の減弱の時間的なずれを検討する目的で、肝細胞の小胞体含有標品を調製し、Ca²⁺ストアからのIP₃感受性Ca²⁺放出を測定した。高密度培養細胞由来の小胞体におけるIP₃感受性Ca²⁺放出は、培養時間の経過に伴って変動することはなかったが、低密度培養細胞由来のものでは、IP₃の濃度依存的なCa²⁺放出が高濃度側に移行しており、またIP₃の添加によるCa²⁺放出能も低下していることが観察された。さらに、この小胞体含有標品へのIP₃結合活性を測定したところ、低細胞密度で培養した場合にのみ、培養時間の経過に依存してIP₃結合部位数が急速に減少していくことが明らかにされた。すなわち、「→転換」の初期に観察される受容体刺激によるIP₃生成と細胞内からのCa²⁺動員の時間的なずれは、IP₃結合部位の減少を伴う、Ca²⁺ストアからのIP₃に応答したCa²⁺放出の減少に起因することが示された。

「→転換」と細胞外Ca²⁺の流入

　細胞内Ca²⁺濃度の上昇は細胞外液からの流入によっても発現するので、受容体刺激による細胞外Ca²⁺の流入を"Ca²⁺の後添加法"を用いて測定した。高細胞密度培養時には細胞外からのCa²⁺流入が培養時間の経過と共に変動することはなかったが、低細胞密度培養時にはCa²⁺流入が培養時間の経過と共に減少した。しかし、この減少はphosphorylaseの活性化と対応する「→転換」に伴う減少の時間経過と異なり、むしろ受容体刺激によるIP₃生成の減少の時間経過と類似していた。すなわち、細胞外からのCa²⁺流入の「→転換」に伴う減少は、細胞膜上のアドレナリン受容体数の「→転換」に伴う減少と相関すると考えられた。また初代培養肝細胞においては、細胞外からのCa²⁺流入は細胞内のCa²⁺プールが枯渇したことによって起こる二次的なものではなく、細胞内からのCa²⁺動員とは独立したCa²⁺流入経路が存在する可能性が考えられた。

　以上を要するに、本論文は肝細胞の初代培養による「→転換」に伴い、受容体刺激によるIP₃生成応答が減少するが、この生成応答の減少に先行してIP₃による細胞内ストアからのCa²⁺動員能が低下することを明らかにしている。Ca²⁺放出に対するIP₃感受性の低下は、小胞体上のIP₃結合部位の減少に起因すると結論している。また、肝細胞にcyclic ADP-ribose感受性のCa²⁺ストアが存在することを初めて明らかにしている。これらの成果は、今後の肝細胞における細胞内情報伝達系の研究、さらには細胞生理学の進展に有益な知見を提供するものであり、博士(薬学)の学位論文として十分な価値があるものと認められる。