ハイブリドーマ培養上清から抗体を得、パパインによる限定分解によってFabフラグメントを調製し、蒸気拡散平衡法により結晶化した。N1G9 Fabでは沈殿剤として、硫酸アンモニウムを用い、結晶を得た。これにハプテンNPをソーキングして複合体結晶も得た。3B44 Fabは、沈殿剤としてポリエチレングリコールを用い、三浦らの手順に従って結晶化し、ハプテンNPをソーキングした。回折強度データは、イメージングプレートを用いた露光検出装置により収集した。結果を表1にまとめた。

表1.結晶学的パラメータおよび回折強度データの収集

　まずN1G9 Fabの構造を解析し、これをもとにN1G9 Fab-NP複合体と3B44 Fabの構造を解析した。N1G9 Fabは抗体CHA255のFab’(PDBコード:1 IND)を探索モデルとした分子置換法により解析を行った。プログラムMERLOTで回転関数を求め、得られた方位をX-PLORを用いてPC-refinementにより精密化した。その後、MERLOTにより並進位置を求め、モデル構築を行いながら、X-PLORとPROLSOにより結晶学的最小二乗法で構造精密化した。水分子141個を含む構造モデルについて、面間隔15-2.4Åでの結晶学的R因子は0.196となった。N1G9 Fab-NP複合体については、水分子134個を含む構造モデルの面間隔15-2.4ÅでのR因子は0.196となった。3B44 Fabは、N1G9 Fabを探索モデルとした分子置換法により、N1G9と同様の手順で解析を行った。水分子48個を含む構造モデルの面間隔12-2.9ÅでのR因子は、0.218と求められた。

　H鎖およびL鎖はそれぞれ2つのドメインV_HとC_H1、およびV_LとC_Lから成っており、可変領域と定常領域の間のelbow角はN1G9では197°、3B44では206°であった。図1にN1G9 Fab-NP複合体の可変領域(V_HとV_L)を示した。H鎖とL鎖の相補性決定領域(以下CDRと略す)ループは、すべて明瞭な電子密度として観察された。NP分子はCDRループにより形づくられたポケットに見出された。NPとCDRの相互作用はL1、L3、H1、H2およびH3ループにより行われている。

図1.N1G9 Fab-NP複合体の可変領域の主鎖構造。CDRループは太線で描いた。NP分子については、差フーリエ電子密度図を3レベルで示した。

　N1G9 Fabと3B44 Fabは同等のドメイン配置を示しており、可変領域の主鎖原子のrms偏差は0.82Åである。CDRループの側鎖官能基の空間的配置でも、N1G9と3B44はほぼ対応する。図2では、N1G9および3B44の抗原結合部位の三次元構造を比較している。抗原結合部位ポケットは10残基で構成されており、このうちN1G9と3B44で異なるのは33H(N1G9ではTrp/3B44ではLeu)と97H(Tyr/Phe)である。抗原結合部位の底にTrp 96LとTyr 95Hがあり、図の上下には芳香族側鎖としてTyr 32L、Trp 91L、Trp/Leu 33HおよびTyr/Phe 97Hが並び、両端にはHis 35H、Arg 50H、Lys 58HおよびSer 100a/100Hの極性残基が配置している。N1G9のSer 100aHと3B44のSer 100Hは、三次元構造では同等の配置にある。最も多数のコンタクトをしている残基はTrp 91Lである。Trp 96L、His 35H、Arg 50H、Lys 58H、Tyr 95HおよびSer 100a/100HはハプテンNPと6本の水素結合を形成している。

図2.N1G9および3B44 Fabの抗原結合部位。細線でN1G9を、太線で3844を示し、ハプテンと相互作用している残基にラベルを付した。

　3B44のPhe 97HはN1G9のTyr 97Hに相当する位置にあるものの、主鎖側鎖ともN1G9とは構造が異なる。これは、3B44のCDRH3がN1G9に比べて1残基短いためである。この残基は、N1G9および3B44のいずれでも、疎水的な結合部位を構築することにより複合体形成に寄与していると考えられる。N1G9のTrp 33H C3とNPのヒドロキシル基根元の炭素(C4)との距離は3.3Åであり、C3とC4のvan der Waals半径の合計3.7Åを0.4Åしたまわっている。従って、Trp 33HはNPと密なvan der Waals相互作用を生じていると認められる。一方3B44では、Leuへの変異により、33HとNPとの最短距離は、Leu C1とNPのニトロ基酸素の間の3.8Åになっている。これらの原子のvan der Waals半径の合計は3.5Åである。N1G9でみられた33HとNPとの密なvan der Waals相互作用は、TrpからLeuへの変異により緩和され、ハプテン結合により適した抗原結合部位の構造が形成されている。

　抗NP抗体N1G9および3B44のFab-NP複合体構造を比較すると、N1G9のTrp33Hによるハプテンとの相互作用は、原子の過度の近接による反発のエネルギー損をふくむのに対し、3B44では、Leu 33Hへの置換によりこのエネルギー損は緩和され、複合体はより安定化されている。抗NP抗体のaffinity maturationについては、Rajewskyらによって、可変領域の遺伝子の解析と部位特異的突然変異導入の研究がすすめられてきており、ほとんどの二次応答の抗体は33HのTrpからLeuへの体細胞突然変異を伴うこと、また、N1G9にこの変異を導入することによりその親和性2×10^-6Mを二次応答の抗体に相当する値2×10^-7Mまで高められることが明らかにされている。従って、抗NP抗体の一次応答から二次応答への親和性上昇は、N1G9および3B44のFab-NP複合体構造の比較から明らかにした33Hの構造変化によるものと考えられる。すなわち、Trp33Hを側鎖のより小さい残基へ置換して、ハプテンとの密なvan der Waals相互作用を緩和することにより、抗NP抗体のaffinity maturationがすすむと結論できる。