マウス悪性Tリンパ腫CS-21細胞は、mature helper T-cell likeな分化抗原を持つ癌細胞であり、マウス背部皮下に移植すると腋窩リンパ節に高頻度に転移を起こす。一方in vitroでは、CA-12ストローマ細胞と共培養すると増殖できるが、単独で培養しても増殖できずに細胞が萎縮して死滅した。この細胞死の形態をより詳細に透過型電子顕微鏡下にて検討した結果、アポトーシスであることが明かとなった。アポトーシスの生化学的メルクマールであるDNAのヌクレオソームサイズへの断片化を検討した結果、CS-21細胞をCA-12ストローマ細胞から分離すると時間依存的にDNAが180〜200bpに断片化した。CA-12ストローマ細胞の培養上清にはCS-21細胞のDNA合成を誘導する何らかの液性増殖因子が含まれていることが示唆されているが、CS-21細胞のアポトーシスはCA-12ストローマ細胞の培養上清を添加しても抑制されなかった。よってCA-12ストローマ細胞との細胞接着が、CS-21細胞のアポトーシス抑制に重要な役割を果たしていることが示唆された。

　CS-21細胞とCA-12ストローマ細胞の細胞接着に関与する分子を明かにするために、CS-21細胞をラットに脾内免疫してCS-21細胞とCA-12ストローマ細胞の接着を阻害する抗体を作製し、15kDaの抗原を認識する抗体を1クローン、168kDaの抗原を認識する抗体を4クローン、23kDaの抗原を認識する抗体を9クローン得た。これらの抗体の内、168kDa蛋白を認識するMCS-5抗体や23kDa蛋白を認識するMCS-19抗体を添加すると、CS-21細胞のアポトーシスが抑制された。さらにCA-12ストローマ細胞の培養上清存在下でこれらの接着阻害抗体を添加すると、CA-12細胞と共培養したときとほぼ同じ増殖能を示した。これらの結果は、CS-21細胞とCA-12細胞の細胞接着には少なくとも3種類の接着分子(15kDa、23kDa、168kDa蛋白)が関与しており、このうち23kDa及び168kDa蛋白は、細胞接着に関与するだけでなくアポトーシス抑制シグナルをも伝達する分子であり、MCS-5抗体やMCS-19抗体はこうした抗原に対しagonisticに働く抗体であることが示唆された。

　この23kDa蛋白は分子量から膜貫通ドメインを持たない膜結合型蛋白であることが予想されたので、代表的な膜結合型蛋白であるglycosyl-phosphatidylinositol(GPI)-anchored proteinの膜結合ドメインを特異的に切断するphosphatidylinositol-specific phospholipase C(PI-PLC)の作用を検討した。PI-PLCをCS-21細胞に作用させると、MCS-19抗体の反応性が低下し、さらに23kDa蛋白が細胞膜からbuffer中へ遊離することが明かとなり、23kDa蛋白はGPI-anchored proteinであることが示された。GPI-anchored proteinであること、さらに分子量から23kDa蛋白はThy-1分子である可能性が考えられた為、既存の抗Thy-1抗体とMCS-19抗体とのcross-blocking実験及び免疫吸収実験を行なった。その結果23kDa蛋白はThy-1分子であると同定された。また168kDa蛋白は、CD45protein tyrosine phosphatase(PTPase)であることが明かとなった。

　Thy-1抗原は、Tリンパ球に対し抗Thy-1抗体及び二次抗体を作用させて架橋させると一過性の細胞内Ca²⁺濃度の上昇を誘導することが知られている。抗Thy-1抗体によるCS-21細胞のアポトーシス抑制並びに増殖には、こうした一過性の細胞内Ca²⁺濃度の上昇が寄与していることがCyclosporin A(CsA)等の免疫抑制剤を使った実験により明かとなった。またCS-21細胞はPMA添加によってもアポトーシスが阻害され増殖が誘導されるが、このPMAによるアポトーシス阻害メカニズムにはprotein kinase C(PKC)の活性化のみが関与しており、細胞内Ca²⁺濃度の上昇は伴っていない。これらのことからCS-21細胞の増殖には正常T細胞とは異なり、一過性の細胞内Ca²⁺濃度の上昇又はPKCの活性化のどちらか一方のシグナルで十分であることが明かとなった。また抗Thy-1抗体及びPMAによるアポトーシス阻害におけるアポトーシス抑制蛋白bcl-2の発現を検討してみると、PMA処理ではbcl-2の発現誘導が認められたが、意外なことに抗Thy-1抗体処理ではbcl-2の発現は誘導されなかった。これらの結果は、bcl-2 oncoproteinの発現は細胞内Ca²⁺濃度の上昇では誘導されずPKCの活性化によって誘導されることを示すと共に、抗Thy-1抗体によるアポトーシス阻害メカニズムにはbcl-2は関与していないことを示しており、非常に興味深い結果である。

　今回作製した抗Thy-1抗体の内、MCS-34抗体は他の抗Thy-1抗体と異なり二次抗体で架橋してもCS-21細胞のアポトーシスを阻害する活性を示さなかった。逆にこの抗体はPMAによるCS-21細胞の増殖を阻害しアポトーシスを誘導する活性を示すと共に、CA-12細胞非依存的に増殖できるCS-21細胞のvariantであるCS-21ⁿ¹⁵細胞のアポトーシスをも誘導した。MCS-34抗体は通常の抗Thy-1抗体(MCS-19)と比較して、約4倍強く持続的な細胞内Ca²⁺濃度の上昇を起こすこと、及びカルシウムイオノフォアA23187でこうした持続的な細胞内Ca²⁺濃度の上昇を誘導するとPMAによるCS-21細胞の増殖を阻害しアポトーシスを誘導できることから、MCS-34抗体によるアポトーシス誘導メカニズムにこうした持続的な細胞内Ca²⁺濃度の上昇が関与している可能性が示唆される。