図1に示すような手順により/バレル構造を構成する二次構造要素の領域をまず選び出す。

図1./バレル構造予測の手順

　1)/モチーフの候補選出シミュレーション /バレルの構造予測では、どの領域がヘリックス、ターン及び鎖から成る「/モチーフ」に成り得るかを正しく予測しなければならない。そのため、次の2段階の方法を採る。

　a)/モチーフ関数M:/モチーフ中の鎖が連続する7残基のアミノ酸残基から構成されると仮定し、そのN端側5残基とさらにN端側にあるヘリックス部分に相当する8残基分の配列、合計20残基の配列中にどのようなアミノ酸残基(singlet)が出現しているかを検索する。これにより、疎水性アミノ酸残基、親水性アミノ酸残基などの位置によって異なる出現頻度が得られる。また、異なる位置のアミノ酸残基同士の組み合わせ(doublet)の出現頻度を求める。これらの統計データを基に、実際に/モチーフを形成している領域に対する値が、それ以外の領域に対する値よりもできるだけ高くなるような/モチーフ関数Mを定める。

　上式において、s(i)はiの位置におけるアミノ酸残基の出現頻度値、d(i,i’)はiとi’の位置におけるアミノ酸残基の組み合わせの出現頻度値である。/モチーフ領域のM値ができるだけ大きくなるようにs(i)、d(i,i’)に対応した重みW_s(i)、W_d(i,i’)を求める。

　b)triplet消去法:/バレル蛋白質の/モチーフの場合、何残基も離れた別のモチーフと相互作用して構造を形成するため、M値の高いものと低いものが現われ、モチーフ候補の数が100本以上と多くなる。更に候補を絞るために、3残基のアミノ酸残基の組み合わせ(triplet)の寄与も加える。tripletの場合、一次構造のデータが不足しており、tripletの出現頻度を求めることが困難であるため、tripletの寄与を関数Mに加えることは出来ない。そこで、異なるファミリーに類似したtripletがある場合に/モチーフの候補として抽出する方法を試みる。同一のアミノ酸残基同士の類似度を1.00、イソロイシンとロイシンのように物理化学的性質の近い残基同士の類似度を0.96というように1.00に近い値とし、性質の似ていない残基同士の値を0.00に近い値に定める。3残基の類似度の平均値をtriplet間の類似度Rとする。/モチーフ毎に異なるファミリーの一次構造データベースから最高のRをとるtripletを検索する。全ての/モチーフを候補として抽出できるRの下限値R_minを求め、R_minよりも低いR値をとるtripletをもつ領域をモチーフの候補からはずすことにする。20残基から成るモチーフ内の可能なtriplet.の組み合わせの総数(20×19×18)/(3×2×1)＝1140組のR_minを解析すると、この値は0.646〜0.855の間に分布している。R_minの値が0.766以上となるtripletを検索することによって、/モチーフの候補を30本以下に絞ることが可能になる。

　2)鎖の配列による8本の/モチーフの選出シミュレーション

　/バレル蛋白質内で、特に鎖がどのように並んで互いにパッキングして いるかを予測するために8本の鎖の配置を解析する。鎖を二次元に展開すると図2のような主鎖の水素結合様式が得られる。それぞれの鎖の最初のアミノ酸残基に対してC端側の鎖の最初の残基の位置は右側にシフトし、隣接する鎖間のシフト数Nを定めることができる。シフトの現われる鎖は/バレル蛋白質により異なり、70通りの可能性がある。1)で選出した/モチーフの候補から、「正しい8本のモチーフ」を「正しい水素結合様式」になるように選び出せれば三次元構造に組み上げることが可能になる。そのため、次の2種類の関数を組み合わせる。

図2./バレル蛋白質におけるシートの水素結合様式8本の鎖のN端側の残基を左側に示し、N端側の鎖からC端側の鎖へと順に上の行から下の行へと示す。第1行目にあるN端の鎖は第9行目にも示している。バレルの外側に向かう側鎖を持つアミノ酸を上側に、内側に向かう側鎖を持つものを下側に表示し、鎖間の水素結合を破線で示している。バレルの中心軸に対して鎖が円筒上で約36度傾いているため、鎖のシフトが現われる。上流の鎖の最初のアミノ酸残基に対して次の鎖のアミノ酸残基が同じ列から始まる場合にシフト数Nを0とし、その2残基分ずれる場合にNを1とし、4残基分ではNを2とする。いずれの/バレル蛋白質でもシフト数の総和は4となる。TIMの場合は、3、4、7、8番目の鎖のシフト数Nが1となり、他の鎖のNは0となる。

　a)シフト関数S:バレルにおいて、鎖のN端側のターン部分及び鎖は隣の鎖のターンや鎖と相互作用している。そのため、2つの鎖のアミノ酸残基の組み合わせによってシフト数Nが決まると考えられる。隣接する鎖間の正しいシフト数に対応する値が、他のシフト数に対する値よりも高くなるようなシフト関数Sを定める。

　ここで、d_sh(N,i,j’)は鎖m上の位置iと鎖m+1上の位置j’のアミノ酸残基の組み合わせの出現頻度値で、正しいシフト数Nに対するS.の値が最高になるように重みW_sh(N,i,j’)を求める。この関数により、8本の/モチーフの候補に対して、一義的に/バレルを形成する可能性の有無及び可能な水素結合様式を判定できる。

　b)パッキング関数P:/バレルの鎖は隣接する鎖だけでなく、2本先、3本先、4本先の下流側の鎖とも相互作用している。そこで、下流側の鎖との相関関係を考慮し、/バレル構造を実際に構成している/モチーフの組み合わせに対する値が他の組み合わせに対する値よりも高くなるようなパッキング関数Pを定める。

　ここで、d_p(k)(n",i,j")は鎖m上の位置iと鎖mに対してシフト数の和n"の位置にある鎖m+k上の位置j"のアミノ酸残基の組み合わせの出現頻度値で、真の構造に対するPの値が最高となるように、重みw_p(k)(n",i,j")を求める。

　表1に各蛋白質の選出シミュレーションの結果を示す。/バレル蛋白質、/蛋白質の1種であるRossmann foldでは、10〜30本程度の/モチーフ候補が検出されるのに対し、それ以外の蛋白質ではこのモチーフが8本未満しか検出されない場合が多い。

表1.選出シミュレーションの結果

　シフト関数Sで/バレル構造を形成する可能性があると判定される8本のモチーフの組み合わせは、/バレルでは複数検出されるのに対し、Rossmann foldではalcohol dehydrogenaseの1組を除いて検出されていない。さらに、パッキング関数Pで高得点を取る組み合わせはRossmann foldでは検出されないのに対して、バレル蛋白質では多数存在し、本物の8本の配列の組み合わせが最高得点となる。この結果は、この方法が一次構造によるバレル構造とそれ以外のドメイン構造の違いを識別することが可能であり、バレル構造として最良の構造を抽出可能であることを示す。/モチーフのような構造は、離れたポリペプチド鎖と相互作用することによって構造を構築している可能性が高く、離れたポリペプチド鎖との関係を考慮することによって立体構造を正しく予測することが可能になる。

　抽出されたバレル構造を既知の同じ水素結合様式をとる三次元構造と比較して、相違するアミノ酸側鎖を置換し、エネルギー的に安定化させることにより三次元構造の構築も可能となる。今回開発した方法では/バレルのドメイン構造のみしか抽出できないが、Rossmann foldやImmuno-globulin foldなど他のドメイン構造の特性とその一次構造の統計データを求めることによって他のドメイン構造も抽出可能になることが期待される。