CA-12ストローマ細胞から産生される液性因子を同定するために、まずCS-21細胞の増殖に対する様々なcytokineの影響をトリチウムチミジンの取り込みで調べた。その結果、IL-7のみがCS-21細胞の増殖を誘導することが明かとなった(Fig.1)。そこでCA-12ストローマ細胞におけるIL-7のmRNAの発現をRT-PCR法で検討したところ、positive controlとなるSt-2細胞をPMA+LPSで刺激した場合と同じ位置にバンドが検出され、IL-7のmRNAが持続的に発現されていることが認められた。一方、IL-7receptorの発現はBALB/cのthymocyteをcontrolとした場合と同じ位置にバンドが検出され、CS-21細胞で強く発現していることが明かとなった。CS-21細胞にIL-7を添加すると、IL-7の濃度依存的にCS-21細胞のDNAの断片化が抑制されたことから、IL-7はCS-21細胞の増殖を誘導するだけでなく、apoptosisをも阻害することが分かった。DNAの断片化率をDPA法を用いて定量した結果、CS-21細胞単独で培養した時におきるDNAの断片化は20%位であったが、IL-7の濃度を上げると濃度依存的に断片化を抑制し、DNA断片化は5%以下になることが明かとなった。

Fig.1.Effect of various cytokines on CS-21 cell growth.

　apoptosisとの関係が知られている遺伝子としては、apoptosisを阻害する遺伝子としてbcl-2が、apoptosisを誘導する遺伝子としてc-myc、baxなどが知られている。そこで、CS-21細胞のapoptosisを抑制するIL-7を加えて24時間後の、CS-21細胞におけるBcl-2,c-Myc,Bax各蛋白の発現変化を検討した。CS-21細胞はCA-12ストローマ細胞から分離させ単独で培養すると、分離後30分以内にapoptosis抑制に関わるBcl-2の蛋白発現が減少した。おそらくCS-21細胞を単独で培養したときの細胞死はこのapoptosis抑制蛋白Bcl-2の発現減少が関与することが推測される。PKCを活性化するPMAを入れるとBcl-2の蛋白発現が時間依存的に回復し、約8時間後もとの発現levelにまで到達した。また、IL-7を添加した場合にもPMAと同様にBcl-2蛋白の発現が回復された。添加するIL-7の濃度をふって、Bcl-2蛋白の発現変化を検討したところ、Fig.2で示すように添加するIL-7の濃度依存的にBcl-2の発現量が上昇することが明かとなった。IL-7がCS-21細胞におけるBcl-2の発現を回復させることから、Bcl-2のantisenseoligonucleotideを用いてBcl-2の発現を抑制させると、IL-7によるCS-21細胞のapoptosis抑制が阻害されるか否かを検討した。その結果、antisenseを1M添加した際には、同量のsenseを添加した際と比べて、生存細胞数が約30%まで減ることを見いだした。この結果より、IL-7がBcl-2蛋白の発現を増強することによりCS-21細胞の生存細胞数を維持させていることが明かとなった。

Fig.2.Induction of Bcl-2 protein expression by IL-7.

　CA-12ストローマ細胞の培養上清によるCS-21細胞の増殖誘導活性は、IL-7の活性を阻害する抗IL-7中和抗体を添加しても20%程度しか抑制されないことから、CA-12ストローマ細胞の培養上清にはIL-7以外の何らかの液性因子が含まれている可能性が示唆された。そこでこのCA-12ストローマ細胞から産生される液性因子の精製を行なった結果、非常に低分子の液性因子が含まれていることが明かとなったので、以下この低分子の液性因子の同定並びに解析を行なった。

　ある種のlymphocyteやlymphomaでは、SH基を含んだthiol化合物がこれらの細胞の増殖に重要な役割をしていることが明かとなっている。そこでまずCA-12ストローマ細胞からthiolが産生されているかどうかを検討した。thiolにとくに反応性が高いSBDを、CA-12ストローマ細胞の培養上清と反応させてHPLCで分離した。Fig.3(A)でしめすようにCA-12ストローマ細胞の培養上清とSBDを反応させたものでは、一本のシャープなピークが検出されたので、CA-12ストローマ細胞から何らかのthiolが産生されていることが 明かとなった。そこでこのCA-12ストローマ細胞から産生されるthiolを同定するために、SBDと反応させたCA-12ストローマ細胞の培養上清を、Fig.3(B)から(E)でそれぞれ示すようにSBDと反応させたDL-homocysteine、NAC、GSH、cysteineと一緒にHPLC columnにapplyした。その結果(E)で示すようにcysteineと一緒にapplyしたもののみが一つのpeakとなったことから、CA-12ストローマ細胞から産生されるthiolはcysteineであることが明かとなった。CA-12ストローマ細胞の培養上清中のthiol量と、CS-21細胞に対する増殖誘導活性との相関を次に検討した結果、CA-12CM中のthiol量は時間依存的に増加し、これに比例してCS-21細胞に対する増殖誘導活性が増加することが明かとなった。このことから、CA-12ストローマ細胞から持続的に産生されるcysteineが、CS-21細胞の増殖誘導に重要な役割を果たしていることが明かとなった。cysteine以外のthiol基をもった化合物によるCS-21細胞の増殖誘導能は、reduced thiolおよびdithiol-cleaving compoundでも認められた。よってCS-21細胞の増殖には、cysteineのようなSH基をもったthiol化合物が重要な役割を果たしていることが明かになった。

Fig.3.Identification of the thiol produced from CA-12 stromal cells as cysteine.

　CS-21細胞を単独で培養した際におこるCS-21細胞のapoptosisに対して、cysteineがどのような影響を及ぼすかを検討した。その結果、CS-21細胞を単独で培養した際におきるDNAの断片化は、cysteineを添加することによりpositive controlのPMA同様に抑制されたので、cysteineはCS-21細胞のapoptosisを抑制する活性をもっていることが明かとなった。またその際のDNAの断片化は、CA-12CM(75%)やcysteine添加によって阻害された。 次に、cysteine添加によるBcl-2,c-Myc、Baxの発現変化を検討したところ、Bcl-2の蛋白の発現減少は、cysteineを添加しても回復しないことから(Fig.4)、cysteineによるCS-21細胞のapoptosis抑制機構には、Bcl-2蛋白に非依存的な機構が働いているものと思われる⁽³⁾。最近、Bcl-2のhomologがいくつか発見され、apoptosis抑制又はapoptosis誘導に関与していることが報告されているので、こうしたBcl-2 homologの発現変化の関与を今後検討する予定である。

Fig.4.Cysteine suppresses CS-21 cell apoptosis without inducing the expression of Bcl-2 protein.