日本チャールスリバーから購入したICR(Crj:CD-1)親マウスを用いた。飼育は、Conventionalな条件のもとで、Sexual Excitement PeriodにあるFemaleマウス(9〜13週齢)

　を膣の肉眼的な観察により選別し、AM6:00からAM9:00までの3時間のみ、Maleマウス(9〜15週齢)と同居(Mating)させ、妊娠させた。同居の時間を3時間に限定したのは、受精成立時間をできるだけ正確に把握するためである。AM9:00にVaginal Plugを観察し、Plugが確認されたマウスは、AM8:00にConceptionが成立したものとし、その時期を妊娠0日として胎仔の胎齢を起算した。

　受精成立、2、48、72及び96時間後(hpc:hours post conception:(いずれも着床前期))の妊娠マウスをプラスチック製の照射ケージに入れ、¹³⁷Cs-線の全身照射を行った。

　線量は、0.1〜2.5Gyで、線量率は0.2Gy/minである。本研究で個体レベルの胎仔影響を観察するために用いた母獣は、コントロール群44匹と照射群458匹で、生存胎仔はそれぞれ560匹で、4355匹である。

　また、細胞レベルの影響を観察するために用いた母獣は、照射群170匹とコントロール群35匹である。

　胎齢18日目に母獣をcervical verterbral dislocationにより屠殺し、着床率、胎仔死亡、外表奇形の発生率、胎仔体重、性比を観察した。また、2、48、72及び96hpcの受精卵の細胞レベルの変化を観察するために、各時期に放射線照射を行った後、6時間後に卵管と子宮から受精卵を取り出した。集めた受精卵は、0.8%のクエン酸ナトリウムで、低張処理を行い、カルノア液で固定後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行い、観察標本とした。標本は、光学顕微鏡下で、受精卵の細胞数、分裂像及びPycnotic cellの数を観察した。

　個体レベルの影響である着床率、胎仔死亡、外表奇形などは、母獣によって発生率が大きく異なる(Litter Effects)ので、統計処理にはノンパラメトリックなKruskal Wallis検定を用いて分析した。また、胎仔死亡、外表奇形のしきい線量の算定に際しては、SAS-LOGISTIC Procedureを用いてLogistic modelに回帰させた後、5%(LD₅,ED₅)及び10%×2/3の値をしきい線量と判断した。

　胎仔死亡は、(1)着床前死亡(Preimplantation death)、(2)着床後の胎芽死亡(Embryonic death)及び(3)胎仔死亡(Fetal death)の3つに分類した。着床痕、胎盤遺残、吸収胚を胎芽死亡とし、浸軟胎仔を胎仔死亡に分類した。コントロール群の着床率97.1%に比べ、2、48、72、96hpcのすべての照射群で有意に減少した(P<0.001)。2及び48hpcの照射群において、線量依存性が認められた。しかし、72と96hpc照射群の着床前死亡率には、線量依存性が認められなかった。

　コントロール群の胎芽死亡率は、7.41%であるのに対し、すべての照射群の胎芽死亡率に有意に増加が認められた(P<0.001)。胎芽死亡率は、すべての時期の照射群で線量依存性が認められた。

　胎仔死亡率は、着床前期のいずれの時期に照射した場合でもコントロール群と比べ、統計的な有意差は、認められなかった。

　着床前死亡率及び胎芽死亡率をLogisticモデルに回帰させた線量をFigure1と2に示す。回帰曲線から求めた胎芽死亡率のしきい線量をTable1に示す。

Table1.Threshould doses of embryonic death in mice irradiated at each stage during preimplantation period.

　着床前期の早期のほうが着床前期の後期に比べ、より胎仔死亡に対する感受性が高く、受精卵の発育に従い、胚死亡に対して、感受性が低くなる。先行研究でICRマウスの器官形成期の胚死亡のしきい線量は、0.5〜1.5Gyの間であるとされており、着床前期における胚死亡のほうが器官形成期より感受性が高いことが明らかである。

　2、72、96hpcに照射された照射群には、コントロール群では認められない外脳症、口蓋裂、脊椎破裂、無眼球症、尾の異常及び多趾など多くの種類の奇形が認められた。これに対して、48hpcに照射した群(生存胎児586匹)では1匹の外脳症とコントロール群でも認められる丘疹が認められたのみで、他の種類の奇形は、認められなかった。

　48hpcは、外表奇形に対し、感受性はなく、2、72、96hpcには、外表奇形に対して感受性が高いことが明らかである。

　外表奇形の発生率をLogisticモデルに回帰させたものをFigure3に示し、回帰曲線から求めたしきい線量をTable2に示す。2hpcに照射した場合が、最も感受性が高く、しきい線量は0.44Gyである。

Table2.Threshould dose of malformation after -irradiation at each stage in preimplantation period.

図表Figure 1.Regression curves of perimplantation death rate in ICR mice irradimted -ray at 2,48,72 and 96hpc during preimplantation period. / Figure 2.Regression curves of embryonic death rate in ICR mice irradiated -ray at 2,48,72 and 96hpc during preimplantation period. / Figure 3.Regression curve of frequencies of external malformation in ICR mice irradiated -ray at 2hpc.

　これらに対し、先行研究で器官形成期におけるICRマウスの外表奇形のしきい線量は、1.4Gyであるとされている。従って、奇形誘発については、着床前期のほうが器官形成期よりも感受性が高いことが明らかである。

　胎齢18日の胎仔体重において、コントロール群の雌の胎仔体重は、1.323gで、雄の胎仔体重は、1.376gである。照射群とコントロール群の胎仔体重の間には、有意差はなかった。また、放射線による雌雄比の変化も認められなかった。

　2、48、72及び96hpcのICRマウスの胚の1Embryo当たりの細胞数の平均は、それぞれ、1細胞期、6細胞期、28細胞期、88細胞期であった。これは、Heiligenbergerマウスの胚1Embryo(Streffer et al)当たりの細胞数とほぼ同じである。放射線照射により、1胚当たりの細胞数の減少が認められ、48及び96hpcの照射群においては、線量依存性が認められた。

　胚を構成する細胞にPyknosisが認められるものは、受精後48時間後の照射群においては、0.5Gy以上、受精72時間後の照射群では、0.25Gy以上で、受精96時間後の照射群では、0.1Gy以上である。

　本研究の結果では、胚を構成する細胞数の減少は、Pyknosisでは説明できない。そこで、観察時点の細胞数の減少は、細胞周期の延長やPyknosis以外の細胞死、例えばNecrosisも関係しているものと考えられる。また、細胞数の減少と胚死亡率の関係を定量的に説明することもできない。胚死亡の原因については、細胞数以外にCompactionに関る細胞の極性出現、細胞接着因子のE-カドヘリンなどに着目した検討が必要とされる。

　2hpcの1細胞期の胚で多種多様な外表奇形が発生するということは、細胞死が原因ではなく、受精卵の遺伝子の変化が関係しているものと思われる。

　48hpcでは、催奇形性がないことは、48hpcの胚が6細胞期で、Compactionの前であるために、仮に放射線により損傷を受けたとしても他の全能性細胞によって置き換えられるものと考えられる。

　72hpc及び96hpcの胚は、Compactionが起こり、胚体となる原始外胚葉及び胎盤と卵黄となる原始内胚葉、極栄養外胚葉、壁栄養外胚葉に分かれ、特殊な機能・形態学的な細胞に分化する時期であり、変化を受けた細胞によって発生する奇形は異なるために様々なタイプの奇形が発生するものと考えられる。

　本研究の結果、ICRマウスでHeiligenbergerマウスと同様に着床前期の放射線照射により、奇形が誘発され、しかも感受性が器官形成期よりも高いことか明らかになった。したがって、着床前期胚の催奇形性について実験奇形学の視点からの見直しが必要である。

　着床前期の胚は、透明帯の中で卵割を繰り返し、卵管から子宮へ浮遊しながら母親と直接な接続なく、独立な個体として発生してので、化学的、生物的な催奇形要因で、放射線のような物理的要因と同様な奇形が発生するかどうかは不明であり、今後の検討が必要である。

　着床前期は、母親自身も妊娠に気付いていないので、放射線を始めとした催奇形物質(telatogenesis)を意図的に避けることができない。したがって、ヒトヘの適用を考え、他のspeciesでの実験を含めた着床前期の実験的検討がさらに必要である。