TSK gel ODS-80T_Mカラム(粒径5m、150x4.6mmi.d.)、蛍光検出器(東ソー、Ex 325nm、Em 470nm)、UV検出器(東ソー、254nm)などから装置を構成した。溶離液にはA液:10 mMリン酸ナトリウム緩衝液(p113.8)、B液:0.5%ブタノール含有10 mMリン酸ナトリウム緩衝液を使用し、A液とB液の比率を変化させて溶離した(流速1.0ml/min)。

　ANS化オリゴ糖のスルホン酸基のプロトンは、還元末端の第一番目の0-グリコシド結合に選択的に攻撃し、還元末端の1残基を切り離してくれるものと期待される。本法はこうしたANS化反応と切断反応からなるサイクルを繰り返し、各段階で切断されてくるANS化単糖をHPLCで分離、同定し、逐次配列を決定しようとするものである。

　マルトテトラオース(M4)をモデルとし、1段階目の切断反応及び回収について条件検討をした。切断反応は40 mM M4-ANSを有機溶媒中で加熱することにより行った。ANS化M4をDMSO-1-ブタノール5:5中で反応させた後、残存する糖を回収、ANS化した場合にはM1-ANSに比べてM3-ANSが約1.7倍多く検出された。もし切断反応の時に非選択的な分解反応が起こると、M1-ANS:M3-ANSの比は8:lになると計算される。この条件下では比較的選択的な切断反応が起こっていると考えられる。しかし、この場合、選択性は良くなったが、糖の回収率が10%以下であり、次の段階の配列分析を行うのが困難と考えられた。

　前項で述べたようにANS化オリゴ糖を直接配列分析に付す方法では満足しうる結果はえられなかった。この原因として、誘導体中のスルホン酸基が分子内に共存する第2アミノ基との間で双性イオンを形成し、スルホン酸がグリコシド結合切断の役目を果たせない状態になっているのではないかと推定した。そこで、クロロギ酸メチルによりANS化還元性オリゴ糖のアミノ基をMoc化させ(Fig.3)、アミノ基のプロトン化を抑えることによりスルホン酸基の反応性を高める方法について検討することにした。

　但しMoc化することにより誘導体の蛍光は非常に弱くなるので、この場合にはUV検出を用いたFig.4に示した実験操作を用いてMoc化M3(40 mM)を各種比率の1-ブタノール-DMSO(8:2〜4:6)中で90℃、90分間加熱し、1段階目の切断反応率と残存する糖の回収率を求めた。その結果、Moc化M1-ANSの生成率及びM2-ANSの回収率として各々12.9〜45.1%、及び4.4〜26.9%が得られた。これらの結果は、ANS化オリゴ糖を直接切断反応に付した時よりかなり向上しており、Moc化の有効性を示すものといえるが、逐次配列分析を行うには、還元末端1残基目のラベル化糖の生成率、並びに残存する糖の回収率ともになお改善すべき余地があるものと考えられた。そこで、スルホン酸基によるグリコシド結合の切断反応が分子内についてのみ選択的に起こるよう、切断反応時のMoc化ANS糖の濃度を大幅に低く設定する方法を検討することにした。また、反応溶媒のうち1-ブタノールに代えてジオキサンを用いることにした。これはジオキサンがより低極性だからであり、ここで目的とする分子内反応に適格と思われたからである。なお、Moc化していないANS化還元性オリゴ糖の切断反応にジオキサンを用いた場合、アミノ基と糖の結合部分が分解される問題点があったが、Moc化したものはかなり安定であった。M3-Moc-ANSの濃度を45M.ジオキサン-DMSO7:3、反応時間を30分とし、110〜140℃の温度範囲で、切断反応率、回収率などを検討したところ、120℃までは反応が低いが、130℃では切断反応率29%、回収率83%となった。回収した糖をANS化した時M1-ANS:M2-ANSは1:lであった。一方、140℃では切断反応率75%、回収率54.7%であり、回収した糖をANS化した時のM1-ANS:M2-ANSは2.1:1であった。切断反応率、回収率がかなり向上したことが明かであり、Moc化の有効性が証明された。しかし、回収した糖を再度ANS化した時、M2-ANSのみならず相当量のM1-ANSもされていることからさらに改善が望まれる。

図表Fig.3Derivatization Reaction of ANS Labelled Oligosacchrides with Methyl chloroformate / Fig.4Procedure for Sequence Analysis of Reducing Oligosaccharides

　ラクトース(Gal-(1→4)-Glu)、4-0--D-ガラクトピラノシルーD-ガラクトピラノース(Gal-(1→4)-Gal)4’-ガラクトシルラクトース(Gal-(1→4)-Gal-(1→4)-Glu)についてMoc-ANS体の濃度をジオキサンーDMSO(7:3)中45Mとし、切断反応を140℃、30分間行うこととし配列分析を試みた。

3.4.1結果・考察

　各サイクルで還元末端側の1残基目に相当するANS化単糖が検出できたことから本法による配列分析が可能であると考えられた。Fig.5にラクトースの各サイクルにおけるクロマトグラムを示した。

Fig.5Sequence Analysis of Lactose(Gal-(1→4)-Glu)(a)Chromatogram of Moc-Lactose-ANS before cleavage reaction in lst cycle. (b)Cleavage reaction mixture of Moc-Lactose-ANS in lst cycle.Moc-Lactose-ANS(45M)in Dioxane-DMSO(7:3)was heated at 140℃ for 30 min. (C)ANS derivatization products in 2nd cycle.