単細胞藻類である渦鞭毛藻は、新しい生理活性天然物の探索において重要な研究対象となりつつある。近年、渦鞭毛藻より種々の構造と特異的な生理活性を持つ代謝生成物が数多く報告されている。例えば、ブレベトキシンは電位依存性ナトリウムチャンネル活性化剤として、マイトトキシンはカルシウム流入誘発剤として、また、オカダ酸はタンパク質脱リン酸化酵素の阻害剤として注目を集めている。渦鞭毛藻の中でも,生理活性物質の生産という点でAmphidinium属に興味が持たれている。なかでもamphidinolidesA-N,amphidinin A,amphidinoketides.amphidinol(ここではAM1と呼ぶ)がよく知られている。本研究では、Amphidiniumklebsii培養株より新しい生理活性物質の探索した結果、一連の新しい溶血、抗カビ活性物質を発見し、それらの構造決定と生理活性解明を行なったので以下に述べる。

　本研究にて使用した渦鞭毛藻株は、神奈川県三浦市油壷湾海岸にて採取された海藻の表面洗浄液より単離された。これをES-1 supplementを含む滅菌海水中で24℃蛍光灯照明下にて3-4週間で単藻培養した。収穫された細胞をメタノール、アセトンにより抽出、酢酸エチルと水により分配し、水層を1-ブタノールによりさらに抽出した結果、抗カビ活性はブタノール層に見い出された。これを繰り返しカラムクロマトグラフィー(HW-40,50%メタノールー水;Sephadex LH-20,メタノール;ODS,0-50%アセトニトリルー水;逆層HPLC,33%アセトニトリルー水)にて順次分離し、活性物質を単離した。

　溶血抗カビ活性の本体として培養細胞より7つの物質(AM2-AM8)を単離した。これらのうち比較的多量に得られたAM2、AM3、AM5、そしてAM6について構造解明を行なった。このうち主成分のamphidinol 2(13mg)については¹³CNMRスペクトルにて5つのメチル、22のメチレン41のメチン、3つの4級炭素からなる計71本のシグナルが得られ、これらから炭素上の水素数は100と見積もられた。ヒドロキシル基の数は¹³CNMRでの重水素シフトより22と推定された。ここで28本の酸素化された炭素に帰属されるシグナルのうち、シフトしない残り6本については3コのエーテル結合を形成していることが推測できた。また、AM2のアセチル化によってもヒドロキシル基の位置に関する情報が得られた。

　2次元¹H NMRスペクトル(¹H-¹H COSY,DQF-COSY,HMBC)に現われるクロスピークをたどることにより、AM2の部分構造(C1-C23)が解明された。NOESY由来のNOE,¹H-¹H COSY相関様式とともにAM2のC23-C62に関する¹³C NMRデータは、既知のAM1のC25-C65に関するデータと完全に一致し、この部分に関して同一構造を有することを示した。これら全てのデータにより、AM2の平面構造を下記のように帰属した。AM1とAM2の構造上の主な差異は全体の半分(C1-C21)にあり、特にAM2には硫酸エステル基が欠け、新たにTHP(tetrahydronpyron)環を有している。他部位における差異はもう一方の末端部に見られ、AM1でのブタジエン構造がビニル基に代わっている。他の3つ、すなわちAM3、5、6についての構造も同様にNMR解析データをAM1,AM2と比較することにより得られた。AM4、7、8についてこれらの類縁体であることが示された(Fig.1).

Fig.1.Structures of amphidinol analogues(AM1,2,3,5 and 6)

　単離されたアンフィジノール類は、抗カビ性、溶血性、細胞毒性、魚毒性といった多様な生理活性を示した。溶血活性物質として既に知られているアンフィジノール(AM1)は硫酸エステルを有しており、その生理活性上での役割に興味が持たれていた。今回の研究において単離されたアンフィジノール類縁体は硫酸エステルを持たないがTable 1に示すように強い活性を保持している。このことから硫酸エステルの存在は重要ではないか、 AM3と比べた場合むしろ阻害的に作用すると考えられる(Table 1).

Table 1.EC₅₀ values for some bioactivities of amphidinol analogues

　一般的な作用機構を考察するために、種々の濃度のステロイドを含有したリポソームについて、各アンフィジノール同族体(AM2、AM3、AM5)の膜破壊作用を、蛍光剤の漏れを指標として調べた(Fig.2)。

Fig.2 Ergosterol Dependent Membrane Disruption by AM3

　リポソーム中のステロール含有量が増すにつれて、用量依存曲線は低濃度側へ移動した。この実験でも、アンフィジノール類縁体の中でAM3が最も強い活性を示し、その活性は、コレステロール(またはエルゴステロール)33%含有により40倍(または55倍)にまで上昇した。これより作用機構は、生体膜中のステロールと相互作用するとされているアンフォテリシンBの場合と類似している。つまりアンフィジノールは標的細胞の細胞膜中でステロールと結合し、これにより脂質二重膜の配列をみだし水およびイオンに対する隔壁機能を失わせ、あるいは同時にそこに結合するNa⁺/K⁺-ATPaseのような膜酵素を失活させると考えられる。アンフィジノールの溶血性や他の毒性発現は、こうした細胞膜への透過性増大作用に起因すると考えられる。