ニホンヒキガエルおよびアフリカツメガエルの未受精卵ゼリー層を可溶化し、フェノール処理して得られた水層を2-メルカプトエタノールの存在下でWhatman DE52陰イオン交換クロマトグラフィーおよびSephacryl S-500ゲル濾過を行って、主要糖タンパク質B-JGPおよびX-JGP3を得た。二種のカエル卵ゼリー層由来の糖タンパク質は共通して糖含量が高く(約80%)、アミノ酸はSerとThrで約50%を占める。一方、酸性基としてB-JGPはNeuAc残基、X-JGP3は硫酸基に富むことが主な相違点であった。

　それぞれの糖タンパク質からO-結合型糖鎖画分を調製するために、25mgのB-JGPおよびX-JGP3をそれぞれ0.1 N NaOH/1 M NaBH₄中で37℃,48〜50時間処理した。

　OH^-/BH₄^-処理したB-JGPを脱塩後、糖鎖画分をDEAE-Sephadex A-25陰イオン交換力ラムにかけ、中性画分(N)と酸性画分(A)を得た。中性画分はBio-Gel P-4でゲル濾過し、糖鎖画分N-1とN-2を得た。酸性画分はIatrobeadsカラムにかけ、糖鎖画分A-1とA-2を精製した。4つの糖鎖画分について、糖組成分析、メチル化分析、酵素消化、¹H-NMRスペクトル測定を行って、以下のように構造を決定した。

　OH^-/BH₄^-処理したX-JGP3はBio-Gel P-6でゲル濾過し、得られた糖鎖画分(II)をMono-Q HPLCにかけ、中性画分II-0と酸性画分II-1およびII-2を得た。II-1画分はpreparative TLCによりII-1-1〜II-1-5の5画分に分離した。精製された糖鎖画分II-1-2,II-1-4,II-1-5,II-2の糖鎖構造解析を行った。組成分析の結果、II-2は硫酸基を3個、その他は硫酸基を2個もつO-結合型糖鎖であった。温和メタノリシス処理前後の糖鎖のメチル化分析により、硫酸基の結合位置はGalの3位およびGlcNAcの6位であることが明らかとなり、一次元および二次元¹H-NMR測定実験からその結合位置が確認された。それぞれの糖鎖の全体構造はメチル化分析、¹H-NMRスペクトル測定、FAB-MS測定により以下のように決定された。

　X-JGP3の酸性糖鎖は、硫酸基を2個または3個もつコア2型のO-結合型糖鎖であり、いずれも新規な構造であった。それぞれの糖鎖のGalNAcolの6位に結合する糖鎖構造は、3’,6-二硫酸化N-アセチルラクトサミンまたは3’,6-二硫酸化ルイスX構造と呼ぶべき新しい構造であった。GalNAcolの3位に結合する糖鎖構造は、II-2では3-硫酸化Gal、それ以外の糖鎖では血液型A型構造を共通してもち、そこにGlcNAc1→またはFuc1→3GlcNAc1→構造が結合している構造が見出された。Fuc1→3GlcNAc1→3GalNAc1→は新規な構造であった。

　B-JGPおよびX-JGP3はいずれもカエル卵ゼリー層の約50%を占める成分であり、ゼリー層の物理化学的性質、および、受精時と初期発生過程における生物学的機能を担う分子であることが推定された。

　ニホンヒキガエル卵ゼリー層は受精の成立に必要であるが、受精に必須の成分はCa²⁺/Mg²⁺であり、ゼリー層の機能は二価陽イオンを適当な濃度に保持することにあると考えられている。⁴⁵Caを指標とする透析平衡法によってB-JGPのCa²⁺結合性を調べた。その結果、B-JGPは濃度依存的にCa²⁺と結合し、シアリダーゼ処理することでB-JGPのCa²⁺結合性が失われたことからその結合にはシアル酸残基が必要であることが明らかになった。B-JGPとCa²⁺との結合性はJGP濃度7〜10mg/mlを境界にして変わることが示唆されので、JGP濃度3mg/mlおよび20mg/mlにおけるCa²⁺結合性をScatchard分析したところ、3mg/mlのJGP溶液のCa²⁺結合性は20mg/mlのそれと比較して結合定数は2/3倍、結合部位数は1.5倍であった。淡水中に産み出されるヒキガエル卵ゼリー層中においてB-JGPは28mg/mlから約1/3に希釈されることと考え合わせると、B-JGPのCa²⁺結合性の変化は受精が成立する自然環境においてB-JGPが高いCa²⁺結合能をもつしくみが備えられているといえる。アフリカツメガエル卵ゼリー層由来のX-JGP3も同様にCa²⁺結合性を調べたところ、20mg/mlではB-JGPの5倍の結合定数を示した。これはX-JGP3上の硫酸基がB-JGP上のシアル酸よりもCa²⁺との親和性が高いことによると考えられる。

　アフリカツメガエル卵は受精後、卵膜とゼリー層との間にF-層と呼ばれる層が形成されることが知られている。その層の形成は機械的強度が大きくなることと物質的透過性の変化から多精拒否機構のひとつであること、また、その形成には表層顆粒由来レクチン(CGL)とリガンドとの結合が重要であることが知られている。硫酸化糖タンパク質の組織化学的知見からX-JGP3はゼリー層の最内層のJ₁層の主要成分であると考えられ、CGLのリガンド分子であると推定された。そこでELISA法によってCGLとゼリー糖タンパク質との相互作用を調べたところ、X-JGP3はCGLと特異的に結合することがわかった。また、今回アフリカツメガエルから単離したX-JGP3の卵ゼリー糖タンパク質X-JGPO,1,と2はCGLと結合しなかった。X-JGP3は温和メタノリシス処理してもCGLと結合するが、Smith分解によって結合しなくなることから、CGLとの結合にSO42-は必要でなく、末端のFuc残基が必須であることが示唆された。さらにニホンヒキガエルからのB-JGPがCGLと結合することから、CGLが認識する糖鎖構造はFuc1→2Gal1→3(GlcNAc1→6)GalNAc構造であることが裏付けられた。