蛋白質分解酵素(プロテアーゼ)は、その触媒機構から4群(アスパラギン酸、セリン、システインおよび金属プロテアーゼ)に分類されている。これらを阻害するプロテアーゼインヒビターもこれにならい4群に分けられている。その中でシステインプロテアーゼインヒビターについては、これまでのところ動物由来のシスタチンスーパーファミリー(CSF)が構造的にも機能的にもよく研究されてきた。植物にもシステインプロテア-ゼインヒビターは発見されているが、代表的なコメ由来オリザシスタチン、トウモロコシ由来コーンシスタチンもまたCSFの一員である。

　一方パイナップルの茎由来のブロメラインインヒビターVI(BI-VI)は共存するシステインプロテアーゼであるブロメラインを阻害する7種のブロメラインインヒビター群の中の一つである。またBI-VIはシステインプロテアーゼのみならずセリンプロテアーゼであるトリプシン、キモトリプシンもまた若干阻害するという非常に興味深い性質をもつことが本研究によって明らかとなった。このような特徴をもつBI-VIの構造機能相関を明らかにするために、本研究ではBI-VIを単離精製し、その一次構造を決定するとともに、CDおよび二次元NMR法によりその二次構造ならびに三次構造を明らかにした。

　またBI-VIの阻害活性の至適pHは3〜4で、アルカリ性になるに従ってその阻害活性は減少し、pH8では活性がない。この事実と上記のpH範囲でのCDスペクトルの解析結果から、この阻害活性低下は変性などの構造変化によるものではなく、その表面の電荷分布の変化によるものと判断し、BI-VIの酸性および中性領域における解離基のpK値を二次元NMR法により決定した。

　BI-VIはゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。これを過蟻酸酸化し、得られたペプチド鎖をプロテインシークエンサーにより分析しアミノ酸配列を決定した。その結果、BI-VIは軽鎖11残基、重鎖41残基の二本鎖が鎖内および鎖間において5本のS-S結合によって架橋された構造をもつことが判明した(図1A)。

　その三次元構造はプログラムX-PLORのdistance geometry/simulated annealing protocolを用いて計算した。溶液構造は、すでに配列特異的帰属の済んでいる種々のNMRスペクトルより得られた563個の距離情報、35個の二面角情報を用い50個計算した。このうち42個は、5°以上の二面角そして0.5A以上の距離バイオレーションがなかった。その中で収束の良かった18個の集団構造のRMSDsは、構造がよく決まった領域(軽鎖4-8、重鎖5-33残基)の主鎖原子間で0.46Aだった(表1)。BI-VIの溶液構造の主な特徴は、Aドメイン(重鎖9-29残基)そしてBドメイン(重鎖1-7、31-41残基および軽鎖)の2つからなるドメイン構造をとっていることである。それぞれのドメインは3本のストランドで構成される逆平行シート構造から構成されている。Aドメインの2本、Bドメインの3本のS-S結合はそれぞれのドメイン蛋白質のコアを形成しており、そこには疎水性残基の側鎖が存在しなかった。これら5本のS-S結合はそれぞれのシステイン残基のメチレンプロトン間またはプロトンとメチレンプロトンとの間のNOEによって同定され、さらにS-S結合の距離制限を含まない構造計算によっても確認された。

　またBI-VIの解離基のpKを決定するためpH1.6〜9.9の15のHOHAHAスペクトルを測定し、得られたpH titration曲線にカーブフィッティングを行いそれぞれの解離基のpKを決定した。重鎖1,2位のグルタミン酸、9,32位のアスパラギン酸のpK値は通常の値より約1小さかったが、その他の解離基は通常の値とほとんど変わりがなかった(表2)。

　BI-VIの一次構造解析の結果から、この蛋白質はCSF一般に保存されかつパパインとの結合領域であるGln-Val-Val-Ala-Gly配列を持っていなかった(図1A)。またBI-VIは5本のS-S結合を持っているが、CSFの植物由来およびステフィンファミリーに属するシスタチンはS-S架橋を持たない。この事からBI-VIは一次構造上、CSFとは異なるシステインプロテアーゼインヒビターであることがわかった。

　BI-VIは非常にシステイン残基の多い蛋白質でありその軽鎖、重鎖の並べ方によりそのシステインの位置がセリンプロテアーゼインヒビターのそれとよく一致する。この結果はBI-VIがシステインプロテアーゼだけでなくセリンプロテアーゼであるトリプシンとキモトリプシンも若干阻害することを考えると興味深い。本研究によってBI-VIのS-S架橋の位置が決定されたが、軽鎖と重鎖を図1Aのように並べると、その位置はダイズ由来ボーマンバーク型トリプシン・キモトリプシンインヒビター(BBI-I)のそれ(図1B)とよく一致する。BI-VIの溶液構造で軽鎖C末端と重鎖N末端、重鎖C末端と軽鎖N末端がそれぞれ近く、BI-VIの二次構造分布がBBI-Iのそれと類似している事からもこの並べ方は支持される(図1)。またBBI-Iのトリプシン阻害ドメインをBI-VIのAドメイン、キモトリプシン阻害ドメインをBドメインとみなして比較するとそれぞれのトポロジーは互いによく似ている事がわかった(図1)。BBI-Iのキモトリプシン阻害ドメインとBI-VIのBドメイン間では、BI-VIがBBI-Iの場合での33,34位そして43,44位間で切れている点を除けばそのトポロジーはほとんど同じである(図1)。次にBBI-Iのトリプシン阻害ドメインとBI-VIのAドメイン間では、BBI-IがBI-VIでいう重鎖12から21位までの間のループ内で切れかつ重複している他、BI-VIの重鎖21から29位までの逆平行シート構造の長さがBBI-Iの12から24位のそれよりも短く、かつそのヘアピンターンがVI型ではなくI型である。このトリプシン阻害の鍵となっていると推定されているVI型ターンがBI-VIでは3残基短いI型になり、かつBBI-Iのトリプシン阻害活性残基も欠けているため、BI-VIのAドメインにはトリプシン阻害能力がないと推測される。

　BI-VIの軽鎖C末端領域にブロメライン阻害活性部位が存在すると考えられているが、その領域(-Leu-Arg;LRモチーフ)は同じシステインプロテアーゼインヒビターの放線菌由来ロイペプチンのC末端部分と非常によく似ていて、これらもトリプシンを阻害する。またBBI-Iのキモトリプシン阻害活性残基であるロイシンは、それに対応する位置であるBI-VIの軽鎖10位に保存されている(図1)。以上のことを考えるとBI-VIがLRモチーフの存在するBドメインを持つ事が、ブロメライン阻害活性に加えて若干のトリプシン、キモトリプシン阻害活性をもつことにつながっていると考えられる。一方、Aドメインは阻害活性には関与せず、もっぱらBドメインの構造の安定化に寄与しているものと思われる(表1)。

　BI-VIの阻害活性のpH依存性を考えると、pH4.6〜6.2の範囲でもプロトン化しているカルボキシル基が阻害活性に関与していると思われる。pH titration実験の結果から、このような側鎖カルボキシル基は軽鎖5位と重鎖24位のグルタミン酸に絞られる(表2)。実際これらの側鎖のまわりには疎水性残基の側鎖が存在しており、これらの側鎖が電荷を持つと阻害活性に影響を与えるのかもしれない。以上のことを考えると、これらの残基の存在する領域はプロテアーゼとの結合領域であるように思われる。

　結論として構造上の類似点がCSFとBI-VIの間にはなくBBI-IとBI-VIの間に多く存在する事から、BI-VIはシステインプロテアーゼインヒビターでありながらCSFとは祖先を異にし、分子進化的にはおそらくセリンプロテアーゼインヒビターのボーマンバーク型ファミリーと共通の祖先を共有していたと考えられる。BI-VIは進化の過程で軽鎖11位にあたる残基が点突然変異によりセリンからアルギニンにかわり軽鎖、重鎖の順で並ぶ一本鎖として発現された後、プロセッシング酵素(ブロメライン?)によって軽鎖11位の後を