まず最初に、Con Aによって誘導される組織がどのような種類のものなのかを検定するために、組織学的および免疫組織化学的そして分子生物学的手法を用いて検定した。4日間培養した外植体をパラフィン包埋後HE染色して組織分化を調べた結果、神経系組織が主に分化し、500g/mlの濃度のときに100%の神経誘導を引き起こすことが確認された。免疫組織化学的検定法としては、神経特異的なモノクローナル抗体であるNeu-1を用いて、Con A処理した外植体に対して作用させたところ、外植体の内部(表皮を除く)ほぼ全体が認識された。次に、分子生物学的検定法としてRT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)によて神経マーカーや中胚葉マーカーの発現を調べた。Con A処理後の外植体はステージ28相当胚期まで培養したものからRNAを抽出した。この結果、中胚葉マーカーである筋節アクチンの発現は全く見られないが、神経マーカーであるN-CAMの発現は確認された。また、無処理の外植体にはどちらのマーカーの発現も見られなかった。このような結果より、Con Aによって誘導される組織は、中胚葉組織を全く含まない、神経組織だけであり、さらにその神経組織は組織学的に脳や眼という前方構造を含んだものであることが証明された。

　Con Aによって神経誘導を起こした外植体から発現が増加している遺伝子を単離するために、Con A処理していない外植体とsubtractionすることにより求める遺伝子を探索した。con A処理後2時間後の外植体80個よりmRNAを単離し、PCRを利用して増幅しplasmidにligation(Con A(+)library)した。同様に、Con A処理していない外植体もlibraryを作製(Con A(-)library)し、subtractionを行った。この段階で3万の独立クローンが得られたので、さらにdifferential screeningを行ってクローンを選択した。プローブはCon A(+)libraryとCon A(-)libraryからそれぞれ調製し、Con A(+)libraryに有意に発現しているクローンを43クローン単離した。その中で2つのクローンは、databaseにない未知なる遺伝子であったので全長をスクリーニングし、塩基配列を決定した。1つは、HMG(HighMobility Groupに属する遺伝子)というnon-histone proteinの一種であり、ツメガエルでははじめてクローニングされた(以後「HMG-X」と呼ぶ)。またもう一つは、グルタミン合成酵素(GS)というグルタミン酸やアンモニアをグルタミンに変える酵素であった(以後「xGS」と呼ぶ)。これらの遺伝子は、Con Aによって2時間以内に発現が増加し、神経胚期に発現量が著しく増えることがノーザンプロット法によって確認された。どちらの遺伝子もwhole-mount in situ hybridization法で発現場所を調べた結果、母性mRNAとして予定外胚葉域に低レベルの発現がみらる一方、神経胚期において神経板や神経管に大量に発現していることがわかった。さらにGSについてはmethionine sulfoximineという特異的阻害剤によりこの機能を阻害したところ、頭部が著しく欠損した胚となった。この効果はxGS antisense mRNAをinjectionすることによっても確かめられたが再現性は低かった。このようにHMGやGSは神経系に優勢に発現し、神経形成に関わっていることが示唆された。

　Differential Display法(以後「DD法」と呼ぶ)を利用して、Con A処理した外植体にのみ発現し、無処理のものには発現しない遺伝子の単離を第二の方法として行った。最初5つのクローンが取れてきたが、このうち3つはmaternalに存在する遺伝子であった。残り2つの遺伝子をA1,B1とそれぞれ名づけ、それらの塩基配列をホモロジー検索したところ未知なる遺伝子であったので、全長のスクリーニングを試みた。A1についてはたいへん希少な遺伝子であったため、全長のスクリーニングには至らなかったので、B1を中心に解析した。B1は全長4.6kbある遺伝子でホモロジー検索しても特に相同性のある遺伝子はない。予想されるopen readingframe(ORF)は459アミノ酸残基をコードし、アミノ酸レベルのホモロジー検索の結果、N末端約100残基に他の遺伝子と相同性の高い部位が見つかった。それは、インターフェロンやMHC(major histocompatibility complex)の転写制御タンパクであり、相同性の高い部分はそのDNA結合部位に相当した。この結果、B1はDNA結合タンパク質ではないかと示唆された。

　ノーザンプロット法によりその発現時期を調べたところ、ステージ10(初期原腸胚)まではほとんど存在せず、ステージ12(後期原腸胚)になると発現量が上昇した。さらにwhole-mount in situ hybridization法により空間的発現パターンを調べたところ、発現が確認されるのがステージ15(初期神経胚)からで背側の後方より発現する。ステージ18(中期神経胚)になると脳の予定域に発現し、その後中枢神経系を中心に眼や鰓弓などに発現が見られた。このような結果から、B1遺伝子は神経形成の初期に発現しているDNA結合タンパク質であることが示唆された。