| 内容要旨 | | 序 細胞の中で物質の勾配や差異が生じる細胞極性の存在は,生命活動において極めて基本的かつ普遍的な現象である。細胞活動,例えば神経細胞の極性分泌などに深く関与し,また,発生や分化といった現象にも細胞極性が重要な働きをしている.しかし細胞極性の確立維持機構は十分に解明されてはいない. 出芽酵母が芽を形成する際には,細胞極性が確立維持かれ,それに従い細胞骨格系が形成され,細胞骨格系に沿った物質の輸送が行なわれる.RHO3は出芽酵母のras superfamilyに属するrho型の低分子量GTPaseをコードし,芽の成長過程に必要な遺伝子である.低分子量GTPaseはGTP結合型とGDP結合型の間でのコンフォメーション変換を通じて細胞内での情報伝達系のスイッチに当たる役割を果たしており,Rho3pもやはり生体内で分子スイッチとして働いていると考えられる.本研究ではRHO3の関与する経路を解析することで,芽の成長過程におけるRho3pの役割を明らかにし,酵母の芽の形成時の細胞極性維持過程を明らかにすることを試みた.そのためにRHO3の様々な変異遺伝子を用いた解析を行った.また細胞極性の維持の過程をより多面的に解析する目的で,分裂酵母のRHO3遺伝子の相同遺伝子rho3の取得し解析をおこなった. 結果と考察1-1,各種のrho3変異株を用いた遺伝学的解析 ランダムミュータジェネシスによって得られたrho3Asp-198変異及び,イソプレノイドによって修飾されると考えられるC末のCysを欠くrho3Ser-2288変異により,細胞は劣性の高温感受性を示し,これらの変異は不活性型の変異であると考えられる.それらのrho3変異株は制限温度下においてアクチンケーブルを消失し,アクチンパッチが細胞全体に散在するという,細胞極性の失われた表現型を示す(図1).このことよりRho3pは細胞極性の維持に必要であることが示された. 他の低分子量GTPaseの優性活性型変異に相当する変異をRHO3に導入した.それらのうちrho3Ala-131のみが過剰発現させた時増殖に影響を与え,細胞は低温感受性を示した.またrho3Ala-131をゲノム上の野生型のRHO3と置き換えた株は34℃以下の温度では生育が阻害されるという劣性の,極めて強い低温感受性を示した.rho3Ala-131変異の表現型は,RHO3の不活性型変異との二重変異により抑圧されることよりrho3Ala-131は活性型変異と考えられる.RHO3は,他の低分子量GTPaseの優性活性型変異と異なり,活性型変異が劣性になる特異な性質を示す.このことより.Rho3Ala-131pより野生型Rho3pと高い親和性を持つ因子が存在し,その因子がRho3pの機能発現に重要な働きをしているというモデルを考えている(図2).次にrho3Ala-131による低温感受性の表現型を観察した.rho3Ala-131株はいずれも,制限温度下では細胞壁の伸長した細長い細胞となる.アクチンパッチは通常娘細胞部に集中して局在し,母細胞にはアクチンパッチの集合は認められないが,これらの株では母細胞にもアクチンパッチの集合が認められ,それに向かって走るアクチンケーブルが観察され,アクチン系細胞骨格の構成異常が観察された.また細胞壁はしばしばこれらの異常なアクチンパッチの集合体の周辺で歪んでいることが観察される(図3).Con-Aによる染色によって細胞壁の新生部位を黒い影として同定する方法を用いてrho3Ala-131株を解析したところ,rho3Ala-131株は制限温度下では母細胞の中央部や芽の頚部に黒い影が観察され,rho3Ala-131株は制限温度下では細胞壁の新生部位が芽の先端部に局在せず,細胞壁の新生部位の局在が異常になっていることが解る(図4).このことからRho3pはアクチン細胞骨格等の配向の制御を通じて,成長部位を制御していると考えられる. 1-2,RHO3機能の細胞学的解析 抗Rho3抗体を用いた免疫蛍光抗体染色によりRho3pは,野生型細胞において細胞表層全体に点状に散在して存在することがわかった.これに対して活性型変異であるrho3Ala-131を発現させ制限温度下で培養した細胞では,細胞表層全体に点状に散在していたRho3pの一部は凝集して大きな塊となっていた(図5).また不活性型と考えられる高温感受性変異rho3Set-228pの制限温度下における局在を観察したところ,この変異rho3pは野生型と同様に細胞表層全体に点状に散在していたが,点状の構造物は,野生型に比べて小さくなっていた.このように活性型変異と不活性型変異の間で点状の構造物に対照的な違いが認められることから,Rho3pは点状に観察されるRho3pを含む蛋白質複合体の集合,安定性を制御していることが強く示唆される.またrho3Ala-131細胞において,Rho3pを含む凝集物が観察される部位と,細胞壁が異常に伸長する部位とは対応していることが多い.このことは活性型Rho3pを含む複合体が細胞伸長に大きな役割を持つことを示唆する.CDC42は,RHO3と強い遺伝学的関連を示し,出芽の開始を制御するRho型GTPaseをコードしている.野生型細胞においてCdc42pは主に芽の先端部や予定出芽部位の近くに点状の構造物として集合して存在している.ところが活性型変異であるrho3Ala-131を発現させ制限温度下で培養した細胞では,Cdc42pも芽の先端部,予定出芽部位の近く以外に,母細胞内などの細胞壁が異常に伸長している部位にその集合が見られる.このことはCdc42pを含む,蛋白質複合体の細胞内で局在,安定性がRho3pによって制御されている事を示唆している. 2.RHO3関連遺伝子の解析 RHO3欠損を多コピーで抑圧する遺伝子SRO6の塩基配列決定により,SEC4であることを明らかとした.SEC4は分泌小胞が細胞膜へ融合するのに必要なGTPaseをコードする.また,温度感受性rho3変異と温度感受性sec4変異はsec4,rho3二重変異株においてお互いの温度感受性を強める合成致死の表現型を示した.RHO3の活性型変異の低温感受性がsec変異により抑圧されるかを解析した.sec1からsec26の26種類の分泌の変異株に対してrho3Ala-131を過剰発現させたところ,これら変異のうちでsec4-2変異のみがrho3Ala-131の過剰発現による低温感受性を抑圧した.これらのSEC4とRHO3の強い遺伝学的相互作用は,SEC4によって支配される分泌小胞の融合過程がRHO3経路の下流に位置していることを強く示唆するものである(図6).一方温度感受性rho3変異株自身は制限温度下においてもsec変異のような分泌の異常を示ない.したがってRHO3経路は分泌の方向性の制御を行なっているものと考えられる.RHO3経路の下流因子の同定のためrho3Ala-131株の復帰突然変異を取得した.rho3Ala-131株の低温感受性を抑圧し,同時に高温感受性を示す変異株を2株単離し、rch1変異と命名した.相捕性試験の結果これらの変異は同じ遺伝子上の変異であった.rch1変異の表現型、rch1変異株の中でのRho3pの極在は共に高温感受性のrho3変異株の表現型とよく似ており、Rch1pがRHO3経路でRho3pと近い位置で働く因子であることを示唆している。現在このRCH1をクローニングし,解析している.  図表図1 高温感受性rho3変異株の表現型 / 図2 RHO3の活性化機構のモデル / 図3 低温感受性rho3変異株の表現型 / 図4 Con-A染色によるrho3Ala-131株の細胞壁新生部位の特定 / 図5 活性型rho3pの細胞内における局在 / 図6 RHO3とSEC4の遺伝学的関連3,分裂酵母のRHO3遺伝子の相同遺伝子rho3・の取得,解析 出芽酵母の rho3欠損による生育遅延を相補する分裂酵母のcDNAを取得,塩基配列の決定を行ない,分裂酵母のRHO3ホモログをコードするrho3・cDNAを同定した.rho3・は205アミノ酸からなる低分子量GTP結合タンパク質をコードしており出芽酵母のRHO3タンパク質との相同性は73%であった(図7).  図7 RHO3遺伝子産物とrho3・の相同性 RHO3,rho3・が高い相同性を有していること,rho3・が出芽酵母のrho3株の生育遅延を相補することからrho3は分裂酵母におけるRHO3の構造,機能両面においての相同遺伝子であると考えられる.また分裂酵母の2A型のプロテインホスファターゼ,ppe1・,をコードするcDNAもrho3株の生育遅延を相補した.出芽酵母の各種プロテインホスファターゼCMP1,TPD3,PPZ2等の過剰発現によってもrho3株の生育遅延が相補された.このことからRHO3を含む情報伝達系が2A型プロテインホスファターゼの関係する脱燐酸化の系に影響されることが示唆される.現在分裂酵母rho3・の役割を解析している. 結論 本研究では,Rho3p系による細胞極性の維持の機構を解明するために,RHO3の活性型,不活性型変異を同定し,それらを用い,解析をおこなった.その結果Rho3pは芽の形成に必要な蛋白質複合体の集合,安定性を制御していることが示された.またRHO3とSEC4の遺伝学的関連より,SEC4が制御する分泌小胞の細胞膜への融合過程がRHO3経路の下流に位置していることが示唆された.次に分裂酵母のRHO3遺伝子の相同遺伝子rho3・の取得し,Rho3pによる細胞極性の維持の機構が出芽酵母特有のなものではなく,一般的なものである可能性を示した. |
| 審査要旨 | | 細胞の中で物質の勾配や差異が生じる細胞極性の存在は,生命活動において極めて基本的かつ普遍的な現象である。細胞活動,例えば神経細胞の極性分泌などに深く関与し,また,発生や分化といった現象にも細胞極性が重要な働きをしている。しかし細胞極性の確立維持機構は十分に解明されてはいない。 本論文では出芽酵母の出芽をモデルとして,細胞極性の確立維持機構を解析した。本論文の第1章では出芽酵母のras superfamilyに属するrho型の低分子量GTPaseをコードするRHO3遺伝子の遺伝学的解析ならびに細胞学的解析,第2章ではRHO3遺伝子との関連遺伝子の検索と解析、第3章では分裂酵母のRHO3遺伝子ホモログの分離について述べ、最終章において、出芽および芽の成長過程における低分子量GTPaseRho3pの作用機構について考察している。 結果と考察 第1章(i)各種のrho3変異株を用いた遺伝学的解析 ランダムミュータジェネシスによって得られたrho3Asp-198変異及び,イソプレノイドによって修飾されると考えられるC末のCysを欠くrho3Ser-2288変異により,細胞は劣性の高温感受性を示し,これらの変異は不活性型の変異であると考えられる。それらのrho3変異株は制限温度下においてアクチンケーブルを消失し,アクチンパッチが細胞全体に散在するという細胞極性の失われた表現型を示す。このことよりRho3pは細胞極性の維持に必要であることが示された。 他の低分子量GTPaseの優性活性型変異に相当する変異をRHO3に導入した。それらのうちrho3Ala-131のみが過剰発現させた時増殖に影響を与え,細胞は低温感受性を示した。またrho3Ala-131をゲノム上の野生型のRHO3と置き換えた株は34℃以下の温度では生育が阻害されるという劣性の,極めて強い低温感受性を示した。rho3Ala-131変異の表現型は,RHO3の不活性型変異との二重変異により抑圧されることよりrho3Ala-131は活性型変異と考えられる。RHO3は他の低分子量GTPaseの優性活性型変異と異なり,活性型変異が劣性になる特異な性質を示す。このことより,Rho3Ala-131pより野生型Rho3pと高い親和性を持つ因子が存在し,その因子がRho3pの機能発現に重要な働きをしているというモデルを考えている。次にrho3Ala-131による低温感受性の表現型を観察した。rho3Ala-131株はいずれも,制限温度下では細胞壁の伸長した細長い細胞となる。アクチンパッチは通常娘細胞部に集中して局在し,母細胞にはアクチンパッチの集合は認められないが,これらの株では母細胞にもアクチンパッチの集合が認められ,それに向かって走るアクチンケーブルが観察され,アクチン系細胞骨格の構成異常が観察された。また細胞壁はしばしばこれらの異常なアクチンパッチの集合体の周辺で歪んでいることが観察された。Con-Aによる染色によって細胞壁の新生部位を黒い影として同定する方法を用いてrho3Ala-131株を解析したところ,rho3Ala-131株は制限温度下では母細胞の中央部や芽の頚部に黒い影が観察され,rho3Ala-131株は制限温度下では細胞壁の新生部位が芽の先端部に局在せず,細胞壁の新生部位の局在が異常になっていることが解った。このことからRho3pはアクチン細胞骨格等の配向の制御を通じて成長部位を制御していると考えられる。 (ii)RHO3機能の細胞学的解析 抗Rho3p抗体を用いた免疫蛍光抗体染色によりRho3pは,野生型細胞において細胞表層全体に点状に散在して存在することがわかった。これに対して活性型変異であるrho3Ala-131を発現させ制限温度下で培養した細胞では,細胞表層全体に点状に散在していたRho3pの一部は凝集して大きな塊となっていた。また不活性型と考えられる高温感受性変異rho3Ser-228pの制限温度下における局在を観察したところ,この変異rho3pは野生型と同様に細胞表層全体に点状に散在していたが,点状の構造物は,野生型に比べて小さくなっていた。このように活性型変異と不活性型変異の間で点状の構造物に対照的な違いが認められることから,Rho3pは点状に観察されるRho3pを含む蛋白質複合体の集合,安定性を制御していることが強く示唆される。またrho3Ala-131細胞において,Rho3pを含む凝集物が観察される部位と,細胞壁が異常に伸長する部位とは対応していることが多い。このことは活性型Rho3pを含む複合体が細胞伸長に大きな役割を持つことを示唆する。CDC42は,RHO3と強い遺伝学的関連を示し,出芽の開始を制御するRho型GTPaseをコードしている。野生型細胞においてCdc42pは主に芽の先端部や予定出芽部位の近くに点状の構造物として集合して存在している。ところが活性型変異であるrho3Ala-131を発現させ制限温度下で培養した細胞では,Cdc42pも芽の先端部,予定出芽部位の近く以外に,母細胞内などの細胞壁が異常に伸長している部位にその集合が見られる。このことはCdc42pを含む蛋白質複合体の細胞内で局在ならびに安定性がRho3pによって制御されている事を示唆している。 第2章RHO3関連遺伝子の解析 RHO3欠損を多コピーで抑圧する遺伝子SRO6の塩基配列決定により,SEC4であることを明らかとした。SEC4は分泌小胞が細胞膜へ融合するのに必要なGTPaseをコードする。また,温度感受性rho3変異と温度感受性sec4変異はsec4,rho3二重変異株においてお互いの温度感受性を強める合成致死の表現型を示した。RHO3の活性型変異の低温感受性がsec変異により抑圧されるかを解析した。sec1からsec26の26種類の分泌の変異株に対してrho3Ala-131を過剰発現させたところ,これら変異のうちでsec4-2変異のみがrho3Ala-131の過剰発現による低温感受性を抑圧した。これらのSEC4とRHO3の強い遺伝学的相互作用は,SEC4によって支配される分泌小胞の融合過程がRHO3経路の下流に位置していることを強く示唆するものである。一方温度感受性rho3変異株自身は制限温度下においてもsec変異のような分泌の異常を示ない。したがってRHO3経路は分泌の方向性の制御を行なっているものと考えられる。RHO3経路の下流因子の同定のためrho3Ala-131株の復帰突然変異を取得した。rho3Ala-131株の低温感受性を抑圧し,同時に高温感受性を示す変異株を2株単離し、rch1変異と命名した。相捕性試験の結果これらの変異は同じ遺伝子上の変異であった。rch1変異の表現型、rch1変異株の中でのRho3pの極在は共に高温感受性のrho3変異株の表現型とよく似ており、Rch1pがRHO3経路でRho3pと近い位置で働く因子であることを示唆している。現在このRCH1をクローニングし,解析している。 第3章,分裂酵母のRHO3遺伝子の相同遺伝子rho3+の取得,解析 出芽酵母のrho3欠損による生育遅延を相補する分裂酵母のcDNAを取得,塩基配列の決定を行ない,分裂酵母のRHO3ホモログをコードするrho3+cDNAを同定した。rho3+は205アミノ酸からなる低分子量GTP結合タンパク質をコードしており出芽酵母のRHO3タンパク質との相同性は73%であった。RHO3,rho3+が高い相同性を有していること,rho3+が出芽酵母のrho3株の生育遅延を相補することからrho3+は分裂酵母におけるRHO3の構造,機能両面においての相同遺伝子であると考えられる。また分裂酵母の2A型のプロテインホスファターゼ,ppe1+,をコードするcDNAもrho3株の生育遅延を相補した。出芽酵母の各種プロテインホスファターゼCMP1,TPD3,PPZ2等の過剰発現によってもrho3株の生育遅延が相補された。このことからRHO3を含む情報伝達系が2A型プロテインホスファターゼの関係する脱燐酸化の系に影響されることが示唆される.現在分裂酵母rho3+の役割を解析している。 第4章結論 本研究では,Rho3p系による細胞極性の維持の機構を解明するために,RHO3の活性型,不活性型変異を同定し,それらを用い,解析をおこなった。その結果Rho3pは芽の形成に必要な蛋白質複合体の集合,安定性を制御していることが示された。またRHO3とSEC4の遺伝学的関連より,SEC4が制御する分泌小胞の細胞膜への融合過程がRHO3経路の下流に位置していることが示唆された。次に分裂酵母のRHO3遺伝子の相同遺伝子rho3+の取得し,Rho3pによる細胞極性の維持の機構が出芽酵母特有のなものではなく,一般的なものである可能性を示した。 以上のように本論文は出芽酵母のRHO3遺伝子の解析を通しで低分子量GTPaseの出芽過程における細胞極性の確立/維持機構の解明に道筋をつけた。ここで提案されたモデルを基礎に、さらに生化学的研究や細胞生物学的研究をこの研究課題に導入すれば、さらに普遍的な生物現象である細胞極性の形成機構についても重要な貢献が可能であると思われる。公表された論文は共著であるが、実験計画の立案と執行は申請者自身によるもので、他の者はアドバイザーである。以上の評価に基づき、本研究は博士(理学)の学位に十分値するものであることが、審査委員全員の一致により認められた。 |