北アメリカ大陸南西部の乾燥地帯に生育する、キク科の1年生草本P.papposaは夏期に見られる局所的な短期間の集中豪雨のあとにいっせいに発芽し、開花結実までを短期間に行う(Went 1948)。修士課程において、ソノラン・コロラド砂漠に生育する、P.papposaに代表される夏期短命植物を十数種採取し、栽培を試みた。そのうち比較的早く花芽を形成したAmaranthus fimbriatus、Bouteloua barbataおよびP.papposaを試験管内培養したところ、P.papposaが最も早く、種子吸水開始後わずか6日で花芽が観察され、かつ発芽が均一で栄養生長への投資が相対的に少なかった。そこでP.papposaを花芽形成過程の解析の材料として選んだ。

　植物は連続照明条件下、30℃で、MS無機塩にイノシトールと塩酸チアミンを補ったものにショ糖を3%加え、ゲランガムで固化した培地上で無菌培養した。種子発芽誘導は自然下の状態を模倣し、50mlの滅菌蒸留水に長さ3mmの痩果100個を1昼夜浸漬して発根を促した。吸水開始後1日目にはおよそ80%に発根が観察され、それを培地上に移植した。発芽幼植物体の生長の様子を、葉の発達で生長ステージを子葉、第1本葉対、第2本葉対、第3本葉対、花芽として、全体に占める割合で示した。移植した個体の50%が葉を展開するごとにステージが進むものとみなした。2日目には子葉が展開し、4日目には第1本葉対が明確に観察される。7日目には第2本葉対が、10日目には第3本葉対がそれぞれ観察された。第3本葉対の次には花芽が形成される。グラフの傾きから、毎日のサンプリングには生長の早い10%を指標個体として用いることにした。つぎに指標個体の生長の様子を示す。2日目には子葉が展開し、3日目には第1本葉対が肉眼で観察される。4日目には第1本葉対が展開して2mmに伸長し、5日目には5mm、7日目には1cmになる。第2本葉対は6日目に観察され、第3本葉対は8日目に観察された。9日目になると花芽が形成されていることが実体顕微鏡下の観察で明らかになった。

　実際に器官形態形成の場である茎頂を観察することで、外部形態上いつ花芽形成が開始したかを明らかにするために、茎頂の経時形態変化を走査型電子顕微鏡で観察した。吸水開始後2日目にはすでに第1本葉対が200mに発達していたが茎頂分裂組織は平坦であった。3日目になると第1本葉対の間の分裂組織が隆起して、更にその両端には第2本葉対の原基が形成される。4日目には第2本葉対は発達して100mになり、茎頂分裂組織は2日目の状態と異なり、わずかに隆起している。5日目にはその隆起が更に著しくなり、また第3本葉対の原基も形成される。6日目になると茎頂分裂組織はドーム状になり、花のもっとも外側の組織である苞葉の原基が形成された。7日目には(キク科に特徴的な器官である)小花の原基が現れ始め、苞葉が発達して茎頂分裂組織を覆い始め、8日目には完全に覆ってしまう。播種後僅か6日目に花芽形成を開始したことは、P.papposaの栄養生長が極端に短く、しかしその間に3組の本葉対を形成しながらも花芽形成のための準備をしている(いわゆるコンピテントになること)と予想された。そこで、外部形態的に明らかになる花芽形成以前に、花芽形成の場である茎頂分裂組織の内部ではどのような予兆があるのかを解析するために、組織学的に茎頂分裂組織の経時変化を捉えた。

　テクノビット7100樹脂包埋した植物体の茎頂分裂組織切片をDNA染色色素DAPIで染色した。茎頂分裂組織は細胞核が球形で、細胞に対して核の占める割合が大きく、液胞が発達していない細胞質の緻密な細胞で構成されている。吸水開始後2日目の茎頂分裂組織は2〜3層の細胞で構成されており、表層は平坦である。3日目になると細胞屑が3〜4層に増加するが分裂組織の幅は余り変化せず、第2本葉対の原基を形成し始めている。4日目には第2本葉対が発達したために茎頂分裂組織の幅が狭くなり、見かけ上の構成細胞数が減少する。細胞層は顕著には変化しない。5日目になると分裂組織の幅が拡大し、隆起を始める。栄養生長期を通じて並層分裂が部分的に観察されるが、分裂組織層の増大にはあまり関与していないものと思われる。6日目になって生殖生長を始め、分裂組織がドーム状になると随所で並層分裂が見られ、分裂組織を構成する細胞が増大していた。7日目以降になると分裂組織は急激に増大し、細胞質に比較的小型の液胞が数個観察されるようになる。6日目に急激に分裂が盛んになり、分裂組織を構成している細胞数が増加する現象は、5日目以前の茎頂において茎頂分裂組織の細胞分裂周期が変化したことを示唆する。したがって、茎頂の個々の細胞の分裂周期をDNA合成パターンを指標にして解析することにした。

　茎頂分裂組織のDNA合成パターンの経時的変化を、チミジンのアナログである5-ブロモデオキシウリジン(BrdU)をフルオロデオキシウリジン存在下で茎頂に直接取り込ませ、テクノビット樹脂包埋切片上でBrdUに対する蛍光抗体染色によって検出した。従来のトリチウムチミジン法と比較してBrdUテクノビット法は細胞核内のDNA合成様式や個々のオルガネラのDNA合成まで検出できるという特徴がある。さらに、P.papposaの茎頂は取込効率が非常に高く(例えばアラビドプシスと比較して)、わずか1時間のラベルでDNA合成が検出でき、12時間でほぼ全ての細胞に取込が見られるようになった。そこで12時間のラベルで経時的変化を観察した。

　吸水開始後1日目の植物体の茎頂分裂組織には全くDNA合成が見られず、種皮に覆われて未だ展開していない子葉のプラスチドのみがDNA合成をしている。これから12時間たった茎頂分裂組織ではDNA合成を開始した細胞核が観察され、かつオルガネラにも取込が見られる。さらに12時間経過した2日目の茎頂では多数の細胞核に取込が見られるが、分裂組織中央部分の数細胞の細胞核では全く取込が検出されず、DNA合成が停滞していることがわかった。この状態は3.5日まで続くが、その間、周囲の細胞は活発にDNA合成をして栄養生長の形態形成にかかわっている。さらに特異なことは、これらのDNA合成の停滞している細胞核が存在する細胞のオルガネラは周囲の細胞と同様にDNA合成を行っている点である。4日目になると細胞核に全く取込の見られない細胞群は観察されず、分裂組織中央部分にはBrdUを点状に取込んでいる、DNA合成を開始したとおもわれる細胞核が幾つか観察される。5日目にはDNA合成を指標にした、茎頂分裂組織内の区分は不可能になり、花芽形成の開始する6日目にはDNA合成が極大に達した。

　4日目以前の茎頂分裂組織中央部に存在する、細胞核DNA合成の停滞している細胞群は、5日目以降分裂を開始し、花芽形態形成の場である6日目以降の茎頂分裂組織の大部分を占めるようになると推定される。栄養生長期には分裂をせずに休眠しているという意味で、この細胞をドーマントセルと名付けた。栄養生長期の茎頂分裂組織中央部分-ドーマント域-に存在する数個の細胞は花芽形態形成の特異的な情報を持っている可能性がある。さらにドーマントセルは栄養生長期のスペシフィック・マーカーとしてとらえられる。

　7日目以降の茎頂分裂組織は全面的に分化に向かい、最後には茎頂分裂組織という概念はなくなり、集合花を形成する。7日目の茎頂の先端部では未だ層状構造が観察され、分裂組織であることを示していて、DNA合成に関しても大部分の細胞に取込が見られる。しかし、小花の原基が誘導される9日目になるとDNA合成が活発な領域は小花原基に限定され、他の領域では取込率が低下し、分化の進んだことが分かる。さらに小花の原基は11日目になると花弁・雄ずい・花柱の原基と子房の原基に2分される。より分化が進んでいるとおもわれる上部では取込が低下し、このあと胚珠の形成が始まる下部の子房の方がより取込がある。この時点ですでに茎頂分裂組織は認められなくなっている。さらに外部形態形成のほぼ完了した13日目の小花では、DNA合成パターンの差は明確になり、BrdUの取込が見られるのは主に子房である。胚珠の形態形成が始まっており、その部分の細胞核は4日目のドーマント域で見られたような点状の取込を示した。