生物発光分析法は高感度で微量成分の検出ができ、反応の迅速化が可能であることから、注目されている。しかし市販されている昆虫の発光酵素ルシフェラーゼは一般に不安定で免疫診断試薬として用いるのが困難であった。最近になって、東レの風見ら(1)及びThompsonら(2)によりウミホタル(Vargula hilgendorfii)由来のルシフェラーゼのcDNAがクローニングされ、この酵素を免疫診断試薬へ応用することが考えられるようになった。この酵素は乾燥状態で長期にわたり安定であり、発光機構が非常に単純でATPなどのエネルギー源を必要とせず、また生成物阻害が見られないという特徴を持つ。

　化学的手法を用いてこの様な酵素を抗体などと結合した場合、酵素の活性が低くなったり、酵素と抗体の結合物の収量が低かったりするため、本研究では遺伝子のレベルでこれら二つの蛋白質を結合することを試みた。

　本研究では抗体結合能を持つプロテインA又はプロテインGと発光酵素であるウミホタル・ルシフェラーゼを結合したキメラ蛋白質を作製し、その発光活性及び抗体結合能が保たれていることを確認した。さらにルシフェラーゼのN末端の一部のみをプロテインAと結合したキメラ蛋白質を作製し、ルシフェラーゼの構造機能相関を検討した。

　本研究ではプロテインAのDドメイン(SpA-D)を単独でルシフェラーゼと結合し、キメラ蛋白質を作製した。キメラ蛋白質発現ベクターpRSVPAclucではSpA-D遺伝子の3’末端にルシフェラーゼの遺伝子を結合した。

　COS-1細胞にpRSVPAclucを導入した場合、発現したキメラ蛋白質はルシフェラーゼの発光活性は示すが、SpA-DのIgGへの結合能は示さなかった。そこで、SpA-Dとルシフェラーゼの間にGlyGlyGlyGlySerの配列からなる5残基のアミノ酸のリンカーを導入した発現ベクターpRSVPALcluc(図1)を作製した。新たにこのpRSVPALclucをCOS-1に導入し、発現させたキメラ蛋白質は、発光活性及びIgGへの結合能が共に保たれていることが確認された。これは、リンカーの存在によってSpA-DのC末端(3)が正しい構造を形成でき、これがSpA-D全体の安定性を増したため、IgGへの結合能を保つことが出来たものと考えられる。さらに抗ルシフェラーゼ抗体を用いたWestern blotを図2に示す。その結果、分子量約76kDaのキメラ蛋白のバンドが確認できた(図2,lane1,2)。

図1 キメラ発現ベクター構築図

　このキメラ蛋白質を動物細胞で安定に生産させるため、CHO細胞にpRSVPALclucを導入した株を作製した。この株で遺伝子増幅を行った結果、培養上清に約100g/1のキメラ蛋白質を分泌させる事が出来た(図2,lane5,7)。

図2 発現したキメラ蛋白のWestern blot解析Lanes 1 & 2 : Cell lysates of COS cells transfected with pRSVPAcluc and pRSVPALcluc respectively, 3 : Mock transfection, 4 : The cell lysate of COS cells transfected with pccluc, 5 : stably transfected CHO cells with plasmid pRSVPALcluc, 6 & 7 : Culture supernatants of COS and CHO cells respectively transfected with pRSVPALclue.

　キメラ蛋白質SpA-D-ルシフェラーゼの免疫測定法への応用の可能性を評価するため幾つかのアッセイを行った。このキメラ蛋白は培養上清に分泌されているので、未精製の状態でキメラ蛋白質を測定系に用いることが可能であった。図3にヒトIgG-Sepharoseの濃度に対する発光活性の依存性を示す。IgG-Sepharoseを用いて10^-9g/mlの感度でヒトIgGを検出できた。

　さらに、サンドイッチELISA法によってモノクローナル・マウス抗Tri-nitrophenyl(TNP)抗体の定量を行った。TNP-Sepharoseに種々の濃度で抗TNP抗体を固定し、ウサギ・抗マウスIgG抗体を反応させ、さらにキメラ蛋白質をこれに反応させた。このようにして抗TNP抗体に、ウサギ抗マウス抗体を介してキメラ蛋白質を固定し、その発光活性を測定した結果を図4に示す。発光活性はマウス抗TNP抗体の濃度に依存することが示された。

図表図3 IgG-Sepharose濃度に対する発光活性の依存性 / 図4 抗TNP抗体を用いたサンドイッチELISA

　以上の結果から、発光活性と抗体結合能の二つの機能を同時に持つキメラ蛋白質を用いた高感度な免疫測定が可能であることが確認できた。

　プロテインAは結合特性が限定されてるため、本研究では各種のIgGに結合するプロテインGを用いることにした。プロテインGの3つのIgG結合ドメインの内、IgGのFc領域との結合状態での立体構造が明らかになっているB1ドメインをルシフェラーゼのN末端に結合する事にし、pRSVPGLclucを作製した。しかし、このベクターより発現させたキメラ蛋白ではFc領域との結合能は失われていた。この原因はプロテインGの立体構造が保たれなかったためと考えられ、そこで3つのヘリックスを持つプロテインAをプロテインGとルシフェラーゼの間に導入することでプロテインGが正しい構造を取るものと期待し、pcPGALclucを作製した。ヤギIgGに対するプロテインAの結合能は低いがプロテインGは高いことが分かっているため、このベクターより発現したキメラ蛋白の結合特性を解析するために、様々な濃度のヤギIgGにキメラ蛋白を反応させた。その結果、プロテインGの活性が回復したことが明らかになった。さらに、この蛋白質と4章で作製したプロテインA-ルシフェラーゼキメラ蛋白質のヒトIgG-Sepharoseに対する結合量の比較測定を行った結果を図5に示す。抗体結合ドメインを二つにすることでルシフェラーゼの発光量が2倍に上昇したことが分かる。以上の結果より、このキメラ蛋白を用いることで、免疫測定の感度をより高めることが可能になると期待できる。

図5 キメラ蛋白SpA-ルシフェラーゼ及びSpG-SpA-ルシフェラーゼを用いた結合活性の比較

　ウミホタル・ルシフェラーゼの発光にはATPなどの高エネルギー化合物を必要とせず、その反応機構は他のルシフェラーゼに比べ単純である。このようなユニークな発光酵素であることに着目し、ウミホタル・ルシフェラーゼの内部ホモロジーを調べたところ、二つの領域(residucs 81-312,321-540)間のアミノ酸ホモロジーは19.3%であった。これらの領域はapoacquorinのアミノ酸配列にもホモロジーが高いことが報告されている。このような特徴からN末端側のホモロジーの高い領域単独でも発光活性を示すのではないかと考え、本研究ではpRSVPALclucTを構築し、蛋白質を発現させ、その構造機能相関を明らかにする事を試みた。

　まずpRSVPALclucのルシフェラーゼ部位を遺伝子操作によって切り詰め、pRSVPALclucTを作製した。その構造を図6に示す。このベクターをCOS-1細胞に導入し、発現したキメラ蛋白質が切り詰められていることをWestern Blottingにより確認した。

図6 ウミホタル・ルシフェラーゼを切り詰めた発現ベクターの構築図

　この蛋白の発光活性を測定したところ、N末端側領域のみを持つキメラ蛋白質(pRSVPALclucT)はルシフェラーゼの全領域を含むキメラ蛋白質(pRSVPALcluc)の約38%の発光活性を示した。これらの結果から、ウミホタル・ルシフェラーゼの発光にはホモロジーの高い領域単独でも発光活性を示すことが明らかになった。さらに図7に示すようにこのキメラ蛋白を免疫測定法に応用できることを明らかにした。

図7 切り詰めたルシフェラーゼを用いた発光活性のIgG濃度依存性

　本研究では、数多くの標識用酵素の中から特にウミホタルのルシフェラーゼの特質に注目し、プロテインAの抗体結合ドメインとのキメラ蛋白質を作製し、これが免疫診断等に応用できる可能性を示した。本研究の成果より以下のことが示された。

　1.発現ベクターpRSVPALclucを動物細胞に導入することで発光活性とIgG結合能を共に持つSpA-Dとルシフェラーゼのキメラ蛋白質を培地中に分泌させることに成功した。

　2.(Gly)4SerのリンカーをSpA-Dとルシフェラーゼの間に導入することで、SpAの単独のドメインをキメラ蛋白として安定に発現させ、そのIgG結合能を保つことが出来た。

　3.1と同様にプロテインG-ルシフェラーゼ発現ベクターpRSVPGLclucを動物細胞で発現したが、プロテインGのIgG結合能が低下していた。そこで3ヘリックスを持つプロテインAをプロテインG及びルシフェラーゼの間に導入することでプロテインGのIgG結合能が回復した。この結果から、キメラ蛋白を設計する際には結合する蛋白質同士の三次元構造レベルでの相互作用を考える必要があることが判明した。

　4.本研究で作製したキメラ蛋白を用いて免疫測定を行った結果、抗体や抗原を高感度で定量出来ることが示された。

　5.ルシフェラーゼのN末端側の領域のみを持つプロテインA-ルシフェラーゼを解析した結果、ルシフェラーゼの全領域を含むプロテインA-ルシフェラーゼに対し約38%の発光活性が保たれることが判明した。