A.phyllitidisなど4種のAnemia属シダの主要造精器誘導物質であるantheridic acid(1)は9,15-cyclo-GA₉(GA₁₀₃:2a)から3-hydroxy-9,15-cyclo-GA₉(GA₁₀₇:2e)を経て生合成されることが明らかにされている(Yamauchi et al.1991)が、GA₁₀₃やA.phyllitidisの微量成分として同定された3-epi-GA₆₃(4d)の生合成経路については未解明である。また、Lygodium属のシダの主要造精器誘導物質であるGA₇₃-Me(3a)の前駆体がGA₂₄であることが明らかにされている(山内 1993)が、その間どのような変換を経るかについては分かっていない。本研究では、これら造精器誘導物質の生合成経路に関する未解明の部分を明らかにするための基礎的知見を得るため、これまで造精器誘導物質の詳細な分析が行われていなかった種について造精器誘導物質の検索を行った。

c.ジテルペン炭化水素の検索

　フサシダ科植物の造精器誘導物質はGA関連構造を有しているので、GAと同様、ent-kaurene等のジテルペン炭化水素を生合成前駆体としていると考えられる。そこで、A.phyllitidis,A.flexuosa,L.japonicum,L.flexuosumの前葉体に含まれるジテルペン炭化水素の検索を行った。その結果、全ての試料よりent-kaurene及びent-9,15-cyclokaurene様物質が検出された。

図2 フサシダ科植物から検出されたジテルペン炭化水素の構造

　最近、これまでフサシダ科植物にしか検出されていなかった、9,11-didchydro構造を有するGAがリンゴ未熟種子に存在することが報告された(Hedden et al.1993)。そこで、9,11-didchydro-GAの生合成経路に関する基礎的知見を得るために、開花後10週目及び14週目のリンゴ未熟種子における造精器誘導物質関連化合物の精査、及びジテルペン炭化水素の検索を行った。その結果、10週目の種子からは23種の既知GA及び6種の9,15-cyclo-GA、14週目の種子からは17種の既知GA及び5種の9,15-cyclo-GAが同定された。ここで極めて興味深い点は、9,11-didehydro-GAsとして既報のGA₈₈に加え、GA₇₃が種子植物より初めて同定されたこと、及び9,11-didehydro-GAと同様にフサシダ科植物の造精器誘導物質として見い出されていた9,15-cyclo-GAが同定されたことである。特にGA₁₀₃,GA₁₀₅(2c),GA₁₀₆(2d),GA₁₀₈(2f)は天然から初めて同定されたものである。以上のことから、リンゴ未熟種子はent-9,15-cyclogibberell-16-ene骨格、ent-gibberell-9(11),16-diene骨格を有するGAの生合成経路を追究するための好適な材料となる可能性が示唆された。また、リンゴ未熟種子中のジテルペン炭化水素についても検索したところ、ent-kaurene及びent-9,15-cyclokaurene様物質が検出された。

　A.phyllitidisから同定された造精器誘導物質はGA関連構造を有するが、前葉体から胞子体にいたるシダの生活環のなかで、それら造精器誘導物質が質的・量的にどのように変動するのか、またGAが存在するとすればどの生育段階にどのようなGAが存在するのかきわめて興味深い。ここではA.phyllitidisの前葉体、胞子体各々2つの生育段階について、造精器誘導物質及びジベレリンについて定性・定量分析を行い、造精器誘導物質、GAの生理的役割について考察した。A.phyllitidisの前葉体については播種後4週間目と6週間目、胞子体については播種後1年目と2年目のものを分析した。4週間目の前葉体では、GA₉が痕跡量存在する可能性が示されたが、antheridic acidの存在は認められなかった。また6週間目の前葉体ではantheridic acidと、3-epi-GA₆₃及びantheridic acidのisomerと考えられる物質が検出され、さらにGA₉,GA₂₄,GA₂₅が同定された。一方、比較的若い成長段階である1年目の胞子体からGA₄,GA₉,GA₁₅,GA₂₀,GA₂₄が、主として成熟葉より成る胞子体からGA₄,GA₉,GA₁₅,GA₁₉,GA₂₀,GA₂₄が同定されたが、いずれの胞子体からもantheridic acidなどの造精器誘導物質は検出されなかった。定量分析では、4週間目の前葉体におけるGAレベルはきわめて低く、6週間目の前葉体ではantheridic acid,GAのレベルが顕著に高くなっていることが示された。特にantheridic acidのレベルは高く、GAの中では最も多量に存在するGA₂₄の少なくとも3倍は存在した。以上の事実は、播種後、4-6週間の間に造精器誘導物質及びGAの生合成が飛躍的に高まることを示している。GA間の比較では前葉体と胞子体の間でGA₂₄とGA₉の量に顕著な差がみられた。6週間目の前葉体ではGA₂₅がGA₂₄と同程度存在し、前葉体におけるGA₂₄の主要代謝物はGA₂₅であることが示された。GA₉は少量存在するものの、GA₄の存在は認められなかった。胞子体においてはGA₉が主要内生GAであり、高等植物における活性型GAと考えられるGA₄の存在も認められた。

　本研究において、胞子体や播種後4週間目の若い前葉体にantheridic acidの存在が認められなかったことにより、antheridic acidが半数世代において播種後4-6週間に時期特異的に生成分泌されることが示された。A.phyllitidisにおいて造精器形成は播種後5週間目頃より認められることから考えると、antheridic acidの主たる生理的機能は造精器の分化・形成の制御であることが示唆されたものといえる。一方、GAは比較的発達した前葉体及び胞子体から同定されたが、主要GAは胞子体ではGA₉,GA₄であり、前葉体ではGA₂₄,GA₂₅であった。以上の事実よりA.phyllitidisにおけるGAの主要生合成経路はearly-non-hydroxylation pathwayであること、胞子体と前葉体では活性型と考えられるGA₄のレベルに顕著な違いがあることが示された。

　ここで用いた前葉体と胞子体についてもジテルペン炭化水素の検索を行った。その結果、6週間目の前葉体及び胞子体からent-kaurene、6週間目の前葉体からのみent-9,15-cyclokaurene様物質が検出された。(1)の結果も併せると、造精器誘導物質の生合成とent-9,15-cyclokaurene様物質は密接な関連がある可能性が考えられる。

　リンゴ未熟種子及びシダ前葉体より調製したセルフリー系、ならびにシダ前葉体を用いて生合成前駆体候補化合物の代謝実験を行ったが、9,11-didehydro-GA及び9,15-cyclo-GAの生合成経路を解明するための知見は得られなかった。一方、A.phyllitidisにおいてはantheridic acidがent-kaureneを経由して生合成されるのか、あるいはent-kaureneを経ずにent-9,15-cyclokaurene様物質から生合成されるのかを調べるために以下の実験を行った。すなわち、ent-kaurene代謝阻害剤であるuniconazole-Pを含む培地上で生育させたA.phyllitidis前葉体を分析したところ、ent-kaureneはcontrolの約80倍の蓄積が見られたが、ent-9,15-cyclokaurene様物質は約2倍に増加したにすぎなかった。また、その場合に前葉体から培地に分泌されるantheridic acidはcontrolの約1/13となった。以上の結果はent-kaureneがGAだけでなくantheridic acidの前駆体であることを示唆するものである。ent-9,15-Cyclokaurene様物質が実際にent-9,15-cyclokaureneであり、ent-kaureneがその前駆体であるとすればent-kaureneからent-9,15-cyclokaureneへの変換はuniconazole-Pにより阻害されるものと考えられる。いずれにしてもent-9,15-cyclokaurene様物質の構造解明はantheridic acidの生合成を考える上できわめて重要であると考えられる。

　ent-Kaureneは造精器誘導物質の生合成前駆体と考えられることから、ent-kaurene合成酵素A遺伝子(KSA)のcDNAクローニングをL.circinnatum前葉体について試みた。現在、L.circinnatum前葉体から調製したcDNAを鋳型として用いて、シロイヌナズナのKSA遺伝子に基づいて作成したプライマーをプローブとしたPCR法によりシダKSAのクローニングを試みている。

　本研究によってフサシダ科植物の造精器誘導物質について以下に示すような新しい知見が得られた。M.caffrorumの造精器誘導物質の主成分は3-epi-GA₆₃であり、M.caffrorumは3-epi-GA₆₃の生合成経路追究の好適な材料である可能性が示された。L.flexuosumの前葉体培養液あるいは前葉体のメタノール抽出物より造精器誘導物質としてGA₇₃-Meの他にその変換物と考えられる数種の新規物質を検出した。また、GA₇₃や9,15-cyclo-GA類を種子植物(リンゴ未熟種子)から初めて同定した。さらに、A.phyllitidis生活環の中での造精器誘導物質やGAの変動を調べ、造精器誘導物質が成熟前葉体より時期特異的に生成分泌されていること、胞子体ではGAのみが存在していること等をを明らかにした。また、造精器誘導物質の生合成前駆体候補化合物について検索し、ent-kaurene及びent-9,15-cyclokaurene様物質を検出した。このことから、幾つかの種子植物で得られているent-kaurene合成酵素A遺伝子(KSA)に着目し、L.circinnatum前葉体についてKSAのcDNAクローニングを試みた。