我々の体を構成する最も基本的な要素であるタンパク質は、それを分解するプロテアーゼと、その働きを抑えるプロテアーゼインヒビターの相互作用を通して代謝調節されている。なかでも、システインを触媒残基とするシステインプロテアーゼ(CP)は、その制御の異常が癌の転移、骨粗しょう症の進行などといった病態に深く関与していること、また、人間に害を与えるある種の昆虫や細菌の生育、ウイルスの増殖等に重要な働きをしていることなど、様々な事実が明らかとなってきており、CP自身を対象とした基礎的研究とともに、それを制御するインヒビターについての研究も盛んに行われている。一方、植物界においても、CPが普遍的に存在し、貯蔵タンパク質の成熟化や発芽時の分解といった現象を始めとして、植物体内のタンパク質代謝を司っていることが明らかにされつつある。

　シスタチンはCPを特異的に制御するタンパク質性のインヒビターであり、早くから研究されていた動物由来のものに加え、当研究室におけるコメの2種のオリザシスタチン(OC-I、OC-II)のクローニングによってようやく植物由来のものについても研究が開始された。オリザシスタチンは動物シスタチンとは異なる様々な特徴を有しているため、分子進化的にあらたなファミリーを形成することを予想させる一方、植物種子内でのプロテオリシスの制御への関与といった植物生理面で、あるいはCPを持つ害虫、感染源に対する防御因子としての利用といった応用面で、興味深い研究対象として注目され始めている。

　本研究では、コメ以外の食糧種実、すなわちトウモロコシ、コムギからシスタチンを見出して植物界におけるシスタチンの普遍的な存在を明らかにすることを出発点とし、特にタンパク質代謝系の解析例が少ないコムギについて、種子でのシスタチンの動態を解析するとともに、それが制御するところのコムギ種子CPの検索と、両者の相互作用を検討した。また一方で、シスタチンのプロテアーゼ阻害活性を活用し、人間に害をあたえる昆虫に対する生育抑制効果・致死効果の検討、ウイルスの増殖抑制因子としての効果の検討を通じて、トランスジェニック植物等にそれを応用することを目的とした領域にまで研究を敷衍した。以下に詳細についてまとめる。

　1) 登熟初期のトウモロコシ種子よりcDNAライブラリーを作製し、OC-Iをプローブとしてスクリーニングした結果、全長960bpよりなる陽性クローンを得てこれをコーンシスタチンI(CC-I)と命名した。推定アミノ酸配列によれば、CC-Iはシグナル様配列を含む135アミノ酸残基より成り、シグナル配列部分を除くと、OC-Iと70%の相同性があった。登熟期のトウモロコシについてノーザン解析をしたところ、登熟2週目をピークとして登熟のあらゆる時点での発現が観察された。

　2) コムギのCPインヒビターについては全く解析がなされていないため、まず、すでに構築されたコムギゲノムライブラリーを用いシスタチン分子の有無を検討した。その結果、全長14kbpよりなる1つの陽性クローン(gWC2)の中央部分に既知の植物シスタチンと高い相同性を示す推定アミノ酸配列が存在することがわかり、コムギにおいてもシスタチン分子が存在している可能性が示唆された。そこで、日本の栽培種である農林61号の登熟3週目の種子からcDNAライブラリーを作製し、gWC2をプローブとしてスクリーニングし、制限酵素地図の異なる4種のシスタチンクローン(cWC61、cWC81、cWC83、cWC92)を得た。このうちcWC61とcWC83は93%の相同性を示し、ほぼ同一の分子と考えられた。しかし、cWC61はcWC81とは65%、cWC92とは69%、cWC81とcWC92は65%の相同性を示し、これよりコムギ種子中には少なくとも3種(cWC61/83、cWC81、cWC92)のシスタチン分子が発現しているものと推定された。ノーザン解析を行うと、発現量はcWC61が最も多く、次いでcWC92が多く発現され、cWC81はハイブリダイゼーションによるバンドが僅かしか検出されず、他の2者と比較して発現は非常に少ないと推定された。また発現は登熟2週目をピークとした登熟初期に集中し、登熟1〜3週目に強く発現することが明らかとなった。また発芽初期についても同様の検討を行い、これまでの予想に反してシスタチンは登熟期ばかりでなく発芽期にも強ぐ発現されることを初めて明らかにした。これらの結果は、シスタチンの機能は貯蔵タンパク質のプロテオリシスの制御に限定されず、植物体内での一般的なタンパク質代謝、あるいは新生組織の保護(外敵から防御)といった幅広い役割を果たしているものと推察された。

　cWC61とcWC92をそれぞれ大腸菌にて発現させ、ラットのカテプシンを標的酵素として阻害活性を検討した。同時にOC-I、CC-Iについても同様の検討を行い比較した。cWC61およびcWC92はいずれもカテプシンL、Hを強く阻害(Ki,10^-8〜10^-9M)し、これはOC-I、CC-Iを用いた場合と同程度であった。またカテプシンBに対してはカテプシンL、Hの場合より弱い阻害活性(Ki,10^-7M)を示したが、OC-I、CC-Iよりやや強かった。これより、植物シスタチンは一般にカテプシンL、Hに対しては阻害活性が強く、カテプシンBに対しては阻害活性が弱いという特徴を共有していることが明らかとなった。

　一方、植物に内在するCPの制御には、内在性のシスタチンが大きく関与していると考えられる。このような種子内でのシスタチンの機能の一端を解明する目的で、これまでCPおよびインヒビターの研究がほとんど行われていないコムギ種子を題材とし、CPの検索を行った。まず破砕した完熟コムギ種子をリン酸緩衝液中で撹拌して抽出し、その硫安飽和度75%での沈殿をDE52陰イオン交換カラムにかけてNaCl濃度勾配により分画したところ、カテプシンLの基質となるZ-Phe-Arg-MCAを分解する活性がDTT存在下で著しく上昇する画分を見出だした。これをゲルろ過、陽イオン交換のクロマトグラフィーにより精製した。分子量はゲルろ過から24kDa前後と推定され、Z-Phe-Arg-MCA分解活性の至適pHは5.5であった。本酵素の活性はコムギシスタチンcWC92によって阻害され、その阻害活性はOC-Iで同様の検討をした時よりも強いものであった。以上の結果より、コムギ種子にカテプシンL様のCPが存在することを明らかにするとともに、内在性CPに対する内在性シスタチンの阻害活性を植物で初めて明らかにした。

　最近、我々はコメのオリザイン、オオムギのアリューレイン、ヒトのカテプシンHに相同性の高いCPのcDNAをコムギより単離した。このCPは、ノーザン解析による発現パターンがcWC61とよく似ており、弱いながら登熟期にも発現が観察された。これよりコムギシスタチンは前述のカテプシンL様CPとともに、このカテプシンH様CPも制御している可能性が示唆された。

　以上の結果より、コムギ種子においてのCPとシスタチンの相互作用の一端を明らかとし、コムギにおける貯蔵タンパク質の分解を初めとしたタンパク質代謝に関する研究への途を拓いた。

　農作物を食害する昆虫は、消化管にあるプロテアーゼの働きによってタンパク質を分解し、必須アミノ酸を補給する。農業害虫の多数を含む甲虫目の昆虫を初め、多くの昆虫が消化管酵素としてCPを利用していることが明らかにされつつあり、シスタチンを抗虫因子とする新しいトランスジェニック植物の作出が期待される。以上の背景から、シスタチンの大量培養系が確立しているOC-IとOC-IIを用いて、シスタチンが農業害虫の生育に及ぼす効果を検討した。対象としては豆類を食害する点では共通しているが、昆虫の分類、変態、食餌等の点で大きく異なっているアズキゾウムシとホソヘリカメムシを選び、餌となるササゲに種々の濃度のOC-IとOC-IIを混ぜて飼育した。その結果、シスタチン濃度0.3-0.5%で2種の害虫の生育に対する遅延効果が認められ、1%以上の添加では大部分が羽化しないかあるいは死滅した。これらの結果は、昆虫が食餌中のタンパク質を消化する際にCPがにいかに大きな役割を果たしているかを示唆するとともに、シスタチンが抗虫因子として極めて有用であることを明確に示した。

　我々の体に感染するウイルスの増殖には、しばしばウイルス自身の遺伝子にあるプロテアーゼが必須である場合があり、ウイルスプロテアーゼのインヒビターが選択的な抗ウイルス剤としての期待を集め盛んに研究が行われている。我々は日常的に食物からシスタチンを摂取していると考えられ、シスタチンがウイルスの増殖に対してどのような効果を持つかについて興味がもたれる。そこで、消化管から感染するウイルスであるポリオウイルスおよびロタウイルス、眼球や粘膜の傷口から感染する単純ヘルペスウイルスI型の3種に対する効果を検討した。方法としては、培養細胞にウイルスを感染させ、その後、様々な濃度でシスタチンを添加した培地で培養し、増殖したウイルスを回収して出現するプラークの数で定量し、比較した。ポリオウイルスに対しては、コメ、コムギ、トウモロコシ、の各シスタチンは、いずれも4M以上の濃度で添加すると顕著にウイルス増殖を抑制した。ヘルペスウイルスに対しては、5Mの濃度ではOC-Iの抑制効果を100とすると、cWC92は60程度、CC-Iは10と、シスタチンによってかなりの差が見られた。ロタウイルスに関しては、明確に増殖を抑制するという結果にまでは至らなかったものの、増殖を抑制できる可能性はあると考えられた。以上のように、植物シスタチンは程度に多少の差はあるものの、様々なウイルスの増殖を抑制できることがin vitroでの培養細胞を用いた系で明らかとなった。シスタチンが増殖抑制効果を発揮するメカニズムやin vivoでの効果については推定の域を出ていないのが現状であるが、in vivoでの効果についても検討され始めており、この分野の基礎・応用研究の今後の発展はおおいに期待できる。