既に樹立されている6種のカイコ培養細胞系の中からボンビキシンに対して何らかの応答を示す株が存在するかどうかを調べた結果、BM-N4細胞がボンビキシンに対して形態変化を伴う応答を示すことを見い出した。すなわち、生理濃度である10^-9M以上のボンビキシンーIIを添加することにより、細胞の増殖速度が低下し、肥大化した細胞や紡錘形や繊維芽状に形態変化した細胞が多く見られるようになり、さらには細胞が凝集する活性が見られた。これらの活性は類縁体であるボンビキシンーIVでも観察されたのに対し、他のインスリン族ペプチドであるインスリン、リラキシンでは観察されなかった。このことから、これらの細胞応答はボンビキシン特異的なものであり、BM-N4細胞にボンビキシン受容体が発現している可能性が高いことが示唆された。

　BM-N4細胞に存在するボンビキシン受容体の性質(解離定数、細胞当たりの発現量、分子量など)を明らかにするため、ヨードゲン法を用いてラベル化ボンビキシンを作製し、結合実験を行なった。ラベル化ボンビキシンを10nMから倍々に希釈した系列を作製して細胞とインキュベートし、ラベル化ボンビキシンの細胞への結合量を-カウンターで測定した。各濃度での特異的結合量を基にスキャッチャード解析を行なったところ、BM-N4細胞には解離定数 Kd＝2.36±0.56nM、細胞当たり15,800±1,400の受容体が発現していることが明らかとなった(図1)。

　次に、ボンビキシン受容体の分子量を知るために、化学架橋剤を用いた架橋実験を行なった。ラベル化ボンビキシンと細胞とを4℃でインキュベートして結合させた後、化学架橋剤を用いて共有結合的に架橋することでリガンドー受容体複合体を形成した。細胞を可溶化した後、還元条件もしくは非還元条件下でSDS-PAGEを行なったところ、非還元条件下では300kDa以上の位置に、還元条件下では約105kDaの位置にボンビキシンと特異的に結合するバンドが検出された。また、約190kDaの位置に部分還元物と思われるバンドも検出された。このことから、ボンビキシン受容体はジスルフィド結合を介するサブユニット構造をとっていると考えられた。

　ところで、インスリン受容体をはじめ、増殖因子の受容体の多くはチロシンキナーゼを介する情報伝達系を有することが知られている。そこで、抗ホスホチロシン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、ボンビキシン刺激によりチロシンリン酸化されるタンパク質の有無を調べた。その結果、ボンビキシン添加後、速やかにリン酸化される約92kDaのバンドが検出された。インスリン受容体のサブユニット(95kDa)はインスリン刺激により、自己リン酸化されることが知られており、これらの結果を総合すると、ボンビキシン受容体はインスリン受容体のようなヘテロテトラマー構造を有している可能性が非常に高いと考えられた。推定されるボンビキシン受容体のモデルを図2に示した。

図表図1 スキャッチャード解析 / 図2 インスリン受容体とボンビキシン受容体のモデル

　ボンビキシン受容体のアミノ酸配列等の構造に関する情報を得るために、分子生物学的手法を用いた解析を試みた。受容体タンパク質の解析から、ボンビキシン受容体はインスリン受容体と相同性が高いことが示唆されたため、相同性に基づいたcDNAのクローニングを試みた。インスリン受容体ファミリー間でよく保存されているチロシンキナーゼ領域について複数の混合プライマーを作製し、様々な組み合わせでRT-PCRを行なった。その結果、アニール温度を54℃にした時、一つの組み合わせで、予想される大きさのバンドが増幅された。このDNAをサブクローニングした後、塩基配列を決定したところ、インスリン受容体のチロシンキナーゼ領域と非常に相同性の高い配列であった。そこで、oligo-dT primerおよびrandom primerを用いて2kb以上のcDNAを含むgt10ライブラリーを作製し、PCRで得られた配列をプローブとして、プラークハイブリダイゼーションにより計1.1×10⁶クローンをスクリーニングした。しかしながら、陽性クローンは得られなかった。そこで、次にPCRで得られた配列に対するantisense primerを用いてcDNAを合成することで特異性の高いライブラリーを構築した。4×10⁵クローンをスクリーニングしたところ、最長で2.5kbの6つの陽性クローンが得られた。しかし、そのどれもが開始メチオニンまで達するものではなかった。そこで、5’-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法および3’-RACE法を用いることで、5’側および3’側の非翻訳領域までを含むクローンを得た。このようにして得られたクローンの塩基配列決定を行ない翻訳アミノ酸を解析したところ、サブユニットとサブユニットとの境界と推定されるプロセシング部位LysValLysArg、膜貫通領域と思われる疎水性に富んだアミノ酸配列および21箇所の推定糖鎖付加部位が確認された。また、サプユニットに存在するシステインに富んだ領域のシステインの位置もインスリン受容体とほとんど一致していた(図3)。推定されるサブユニットとサブユニットの分子量はボンビキシン受容体タンパク質の解析から得られた結果に矛盾するものではなく、この遺伝子がボンビキシン受容体であると考えられる。また、スクリーニングの過程でORFの途中から全く異なる塩基配列になっているクローンが数種類得られた。その付近を含むゲノムを解析したところ、exon-intron junctionの位置から塩基配列が替わっていたことから、alternative splicingによるものである可能性が高いと考えられた。今後、COS7などの発現用動物細胞に遺伝子導入して発現させ、ボンビキシンとの相互作用を詳細に調べる必要があると考える。

図3 ボンビキシン受容体とインスリン受容体との構造の類似性