骨は支持器官としての役割と同時にミネラルの貯蔵所としても重要な機能を果たしていることは広く知られている.このため動物は様々な生理状態に応答して常に骨組織の吸収・形成の繰り返し〜すなわち骨代謝回転〜を行い,恒常性を維持している.この骨代謝回転のバランスが崩れ「骨の質的な変化を伴わずに骨量が減少し,骨の強度が骨折閾値を下回った」状態を骨粗鬆症といい,現在,社会的にも大きく問題視される疾病の一つである.骨粗鬆症の発症には,加齢・内分泌疾患・栄養障害など様々な要因が関わることが知られているが,現在までのところこれらの要因が骨代謝回転のどの段階で,どのように作用するのかについては必ずしも明確にされていない.そこで本研究では様々な生理状態の実験動物を用い,骨粗鬆症の成因となり得る種々の要因が骨代謝回転にどのような影響を及ぼすかについて総合的に解析した.

　まず骨代謝の状態を反映する指標として以下のような項目を解析した.(1)カルシウム出納および骨の重量・Ca含量等の骨量に関する計測値.(2)尿中ピリジノリン排泄量:コラーゲンの分子間架橋であるピリジノリンは骨への局在性が高く,骨吸収により遊離して尿中に排泄されるため,その排泄量は吸収された骨の量を反映していると考えられる.(3)血漿中アルカリフォスファターゼ活性:血漿中には骨芽細胞(骨を形成する細胞)に由来する活性の他,肝臓・小腸等由来の活性が存在するが,これらを区別せずに血中の総アルカリフォスファターゼ活性として測定した場合でも測定値が骨形成に正の相関を示すため,骨形成の指標として用いられる.

　次に以下に挙げる骨基質タンパク質のin vivo骨組織における遺伝子発現量の解析を行い,各要因が遺伝子発現のレベルでどのように骨代謝に影響するのか明らかにした.(1)Procollagen 1(I)(以下ColI)および(2)osteocalcin(以下OC):どちらの骨基質タンパク質も骨芽細胞によって産生され,骨の基質タンパク質のほとんどをこの2つで占めることから,両タンパク質の遺伝子発現量の動態は骨芽細胞による骨形成活性を反映していると考えられる.(3)Osteopontin(以下OP):骨吸収を行う細胞である破骨細胞で発現され,破骨細胞自身の骨基質への接着に関与する基質タンパク質であることから,OP遺伝子発現量の変動は少なくとも破骨細胞活性の一部を反映するものであると考えた.

　更に骨代謝回転の制御機構についても検討を加えるため,骨代謝調節における重要な局所因子と考えられているインスリン様成長因子-I(以下IGF-I)およびその結合タンパク質(以下IGFBPs)の遺伝子発現量に注目し解析を進めた.(1)IGF-I:培養細胞を用いた研究より骨芽細胞自身の増殖・分化を促進するとともに破骨細胞の分化にも作用すると考えられているが,様々な骨の病変との関わりについては不明な点が多く残されており,本研究によりIGF-Iがin vivoでどのように骨代謝に作用するのか明らかにしようとした.(2)IGFBPs:主に培養細胞を用いた研究よりIGF-Iの作用を修飾する重要な機能を果たすと考えられてきているが,in vivo骨組織における産生調節および機能についてはほとんど知見が得られておらず,本研究で検討を試みた.

　本研究では様々な生理状態の実験動物を用い、社会的にも大きく問題視される疾病の一つである骨粗鬆症の成因となり得る種々の要因が骨代謝回転にどのような影響を及ぼすかについて明らかにしようとしたもので、論文は緒論とそれに続く4章よりなる。

　緒論では研究の背景を論じた。第1章では成長期のラットにおける骨代謝の動態を明らかにするために、8週齢から12週齢までのラットについて1週ごとにサンプリングし、尿中ピリジノリン排泄量、骨基質タンパク質(procollagen l(I)(以下ColI)、osteocalcin(以下OC)、osteopontin(以下OP))の遺伝子発現量について解析を行った。また骨代謝調節に重要な局所因子であると考えられるIGF-I及びその結合タンパク質遺伝子発現についても解析した。その結果、ピリジノリンの尿中排泄量は経時的に減少し、大腿骨における遺伝子発現量はOPは変動せず、ColIは10週齢まで増加、以後は減少し、OCは経時的に減少していた。これらの結果よりラットは8週齢から12週齢にかけて成長しているが、骨の成長・再構築は特に10週齢以降で減弱する方向にあると結論した。

　第二章では食餌カルシウムの不足および卵巣摘出(以下OVX)によるエストロゲン欠乏が骨代謝に与える影響を検討した。カルシウム含量が異なる食餌を9週齢のWistar系雌ラットに3週間給餌した後、各種指標を解析した。食餌カルシウム含量の制限に応じて骨量は大幅に減少した一方、ColI、OCの遺伝子発現量は増加傾向を示し、この場合の骨量の減少は骨代謝回転の亢進を伴うものであることが示唆された。また、8週齢のWistar系雌ラットより両卵巣を摘出し、カルシウム含量の異なる食餌を3週間給餌した後同様に解析した。その結果、ピリジノリン尿中排泄量および血漿中のアルカリホスファターゼ活性は食餌カルシウム含量の制限及びOVXにより上昇していた。またColIの遺伝子発現量はOVXによってやや増加していた。このときの骨中IGF-I遺伝子発現量はOVXによってやや増加したが、食餌カルシウム含量の制限では全く変動しなかった。IGFBPについては、IGFBP-3がIGF-Iと同様の変動を示す一方、IGFBP-4、-5の遺伝子発現量はOVXによる変動を示さず、食餌カルシウム含量の制限によってはやや増加した。これらの結果よりOVXによる骨代謝回転の亢進は骨組織におけるIGF-Iの産生を介していること、食餌カルシウム含量の制限に応じた骨代謝回転の亢進はIGFBP-4、-5の産生を介していることが考えられた。

　第三章ではストレプトゾトシン(以下STZ)の投与により作製したI型糖尿病モデル動物を用いてインスリンの欠乏が骨代謝にどのような影響をおよぼすかを解析した。糖尿病によりOC、OP、IGF-I、IGFBP-4、-5の各遺伝子発現量は減少しており、一方IGFBP-3遺伝子発現量は増加していた。これらの結果よりI型糖尿病による骨代謝回転低下機構の少なくとも一部に、骨局所におけるIGF-I産生の低下およびIGFBPs産生の変動が関与していることが考えられた。次にI型糖尿病ラットにインスリンを投与後、同様の解析を行った。その結果、尿中のピリジノリン排泄量はインスリンの投与量に応じて減少し、ColI、OC、IGF-I、IGFBP-5の遺伝子発現量はインスリンの投与量に応じて増加していた。従ってI型糖尿病による骨代謝回転の低下はインスリンの投与によって上昇すること、インスリンが骨組織でIGF-I、IGFBP-5の産生を介して骨代謝に影響することが示唆された。

　第四章では合成グルココルチコイドであるデキサメタゾン(以下Dex)を投与、もしくは副腎摘出(以下ADX)ラットにDexを投与してグルココルチコイドの欠乏及び過剰と骨代謝の関係を解析した。Dexの投与により脛骨の幾何学的強度はやや減少し、尿中ピリジノリン排泄量は増加した。このときColI・OCの遺伝子発現量が大きく減少し、IGF-I遺伝子発現量はやや減少していた。一方、IGFBP-3の遺伝子発現量は著しく増大した。これらの結果はDexにより骨形成活性が低下すると同時に骨吸収は増大し、骨量の減少が起こることを示している。また、Dexの骨代謝に対する作用の少なくとも一部はIGF-I、IGFBP-3の産生を介する可能性が示された。次にADXラットにDexを投与したところ、ADXにより顕著に増加したOC遺伝子発現量が減少した。この結果から、OCの遺伝子発現量は生理的なレベルでGCによる調節を受けるが、ColIの遺伝子発現は過剰のGC投与により抑制されることが明らかとなった。IGF-I及びIGFBPsの遺伝子発現は、ADXによっては変動を示さず、Dexの投与量に応じてIGF-I遺伝子発現量は減少し、IGFBP-3遺伝子発現量は顕著に増加した。以上の結果よりIGFやIGFBPsは過剰量のGCに応じて産生が変動し骨代謝に影響すると考えられた。

　以上要するに本論文は骨代謝活性に影響する栄養学的・内分泌学的要因の作用機構を明らかにする目的で、各種モデル動物を用いた詳細な検討を行い、様々な骨代謝の状態について、培養細胞などを用いたin vitro系の研究では観察し得なかった詳細な知見を得たものであり学術上、応用上貢献するところが少なくない。よって審査員一同は、本論文が博士(農学)の学位論文として価値あるものと認めた。