伊豆半島下田市田牛で採集したホヤをエタノールで抽出後、P388マウス白血病細胞対する細胞毒性を指標に活性物質の分離・構造決定を行った。すなわち、抽出液の酢酸エチル可溶部を、90%メタノール/ヘキサンおよび60%メタノール/ジクロロメタンで分配した。得られたジクロロメタン相をアセトニトリル-水系のODSフラッシュクロマトグラフィーで分画したところ、70%アセトニトリルで溶出される画分に活性が集中した。さらにSephadex LH-20によるゲルろ過およびODS-HPLCを用いて精製し、ritterazine(リッテラジン)A-MそしてT-Z(1-13,20-26)と命名した細胞毒性物質を得ることができた。また、ODSフラッシュクロマトグラフィーでメタノールで溶出される画分から、ritterazine N-S(14-19)を分離した。

　Ritterazine A(1)は無色の固体[[]_D+112.0°(c0.1,MeOH)]で、その分子式を高分解能FABマススペクトルからC₅₄H₇₆N₂O₁₀と決定した。¹H NMRおよび¹³C NMRスペクトルから1つの三置換オレフィン、1つのオキシメチン、9つのメチル基および1つのケトン(221.2)の存在が示唆された。次に、各種二次元NMR(¹H-¹H COSY,DQF COSY,and HMQC)スペクトルを解析することにより6個の部分構造を導くことができた。さらに、これらをHMBCスペクトルによってつないで、1の平面構造を得た。なお、構造上重要な14位のスピロ炭素の存在はNMRの解析により確認できた。すなわち、18位のメチルプロトン(1.30)はCOSYスペクトルで水酸基(5.28)と遠隔カップリングを示し、かつHMBCスペクトルにおいて13位(80.9),14位(69.3)および17位(61.7)の炭素との間にクロスピークを与えた。一方、11位(2.35,2.14)および15位(2.08,2.24)のメチレンプロトンとケトン(221.2)の間、ならびに11位のプロトン(2.35)と14位(69.3)の四級炭素の間に¹H-¹³C遠隔結合が認められることから,転位ステロイド骨格の存在が示された。分子左側は通常のステロイド骨格であった。分子式、UV[_max287nm(8580),MeOH]および¹³C NMRスペクトル(149.2,149.2,149.0,148.7)から、二つのステロイド骨格がピラジン環を介して結合している化合物であることが判明した。各ステロイドユニットの相対立体配置は主に結合定数とNOESYスペクトルの詳細な解析から明らかにした。なお、2つのステロイド環のピラジン環を介した結合様式は、¹⁵N-HMBCスペクトルにおいて1位とN2位、1’位とN3位のプロトンと窒素間にクロスピークが観測されたことから、X線結晶構造解析で構造が明らかにされたインド洋産半索動物Cephalodiscus gilchristi由来のcephalostatin 1 と同じことが判明した。Ritterazine D(4)は1の22-エピ体、一方ritterazine E(5)は4の28-メチル体とそれぞれ決定できた。

　Ritterazine B(2)の分子式は高分解能FABマススペクトルからC₅₄H₇₈N₂O₉と決定した。¹H NMR、¹³C NMRおよび各種二次元NMRを詳細に解析した結果、ritterazine Aと同様な構造をもつことが明らかとなった。各ステロイドユニットの相対立体配置は結合定数とNOESYデータから決定した。2つのステロイド環のピラジン環を介した結合様式は、¹⁵N-HMBCスペクトルの測定とN-メチル誘導体のN-メチル基と1位および4’位との間のNOEから1と同じと結論した。Ritterazine C(3)は2と同一の分子式を有し、類似したNMRスペクトルを与えることからその異性体であることが示唆された。NMRおよびFAB-MS/MSスペクトルを詳細に検討した結果、末端の6員環スピロケタールが5員環スピロケタールに変化した構造をとることが判明した。実際、2を重クロロホルム中に放置したところ、約50%が3に変換した。さらに3の絶対立体配置を新Mosher法を用いて決定した。従って、2の絶対立体配置も3と同一と結論できた。Ritterazine F(6)は2の22-エピ体、ritterazine G(7)は6の14-デヒドロ体、ritterazine H(8)は2の12-ケト体、ritterazine I(9)は6の12-ケト-14ヒドロキシル体とそれぞれ決定した。

　Ritterazine J(10)は分子式C₅₄H₇₆N₂O₁₁をもち、もっとも高度に酸化された同族体であった。左半分の構造は2と同じであるが、右半分については14位に二重結合、17位に水酸基が存在し、末端が5,6スピロケタールとなっていた。Ritterazine K(11)は10の7’-デヒドロキシル体、ritterazine L(12)は11の17-デヒドロキシル体、およびritterazine M(13)は12の22-エピ体とそれぞれ明らかにできた。

　Ritterazine N(14)は1の左半分が転位したステロイド骨格で、ritterazine O(15)は14の22’-エピ体、ritterazine P(16)は14の右半分が2と同一、ritterazine Q(17)は16の22’-エピ体、ritterazine R(18)は3の7’,17’,26’-デヒドロキシル-14’-ヒドロ体、そしてritterazine S(19)は18の22’-エピ体とそれぞれ結論された。

　主成分で最も強い活性(IC₅₀＝0.15ng/mL)を持つritterazine B(2)を、HCI/MeOHで処理すると17’位の脱水生成物27が得られ、その活性は2300ng/mL(IC₅₀)と約1/10000に低下した。一方、LiAIH₄/AlCl₃で還元するとF’環が開環したセコ体28が得られ、その活性は240ng/mL(IC₅₀)と約1/1000に低下した。また、PCC/Al₂O₃で酸化すると、1当量では12位が酸化された12-ケト体8が、過剰量ではさらに7’位が酸化された7’-ketoritterazine H(29)が得られた。面白いことに12’位は酸化されなかった。両者はほぼ同じ細胞毒性を示した。

　以上の結果より、ritterazineの活性には17’位の水酸基と左末端の5,6スピロケタールが最も重要であるとが考えられる。また1の7’,17’-デヒドロキシル体であるritterazine T(20)、20の12’-ケト-14’-ヒドロキシル体のritterazine U(21)と16の左末端が5,6スピロケタールとなったritterazine V(22)、20の左末端がスピロ[5,5]となったritterazine W(23)と23の22’-エピ体、ritterazine X(24)の活性が弱いことは、17’位の水酸基の重要性を支持している。しかし、2の7’,17’-デヒドロキシル体のritterazine Y(25)はIC₅₀＝3.5ng/mLの活性を示し、酸条件で処理した脱水生成物27と比較すると17’位の水酸基の有無ではなく、この部分のコンフォメーションおよびフレキシビリィティが重要な意味をもつものと推察される。一方、9-13のように分子内に2つの5,6スピロケタールが存在すと活性が弱く、12位が酸化された8と9、および転位ステロイド骨格をもつ1-5がほぼ同程度の活性をもつなど、構造と活性の関係はかなり複雑である。さらに、右半分が1、左半分が27と酷似したritterazine Z(26)は23と比較して活性が極度に弱かった。1の左半分が転位したステロイド骨格を有する14の活性が弱いことを考慮すると、cephalostatin1の17位と23位の水酸基を含む末端のスピロ環部分が大切であるとの結論が導かれる。

　以上、伊豆半島産群体ホヤRitterella tokioka Kott,1992から、強い細胞毒性を示すステロイド二量体ritterazine類を単離・構造決定するとともに、構造-活性相関に検討を加え、海洋無脊椎動物の抗癌剤としての有用性を示すと同時に、抗癌剤開発にとって重要な知見を得ることができた。

　伊豆半島下田市田牛で採集したホヤのエタノール抽出物を、P388マウス白血病細胞に対する細胞毒性を指標に、溶媒分画、ODSフラッシュクロマトグラフィー、ゲルろ過およびODS-HPLCを用いて分画し、ritterazine A-Zを単離した。

　Ritterazine A(1)は無色の固体[[]_D+112.0°(c0.1,MeOH)]で、その分子式を高分解能FABマススペクトルからC₅₄H₇₆N₂O₁₀と決定した。¹H NMRおよび¹³C NMRスペクトルから1つの三置換オレフィン、1つのオキシメチン、9つのメチル基、および1つのケトンの存在が示唆された。次に、COSYおよびHMQCスペクトルを解析して得られた6個の部分構造を、HMBCスペクトルの解析によってつないで、2つのステロイドがピラジン環を介して結合した特異な化合物であることが判明した。なお分子右側は転位ステロイド骨格を有し、左側は通常のステロイド骨格であった。各ステロイドユニットの相対立体化学は主に結合定数とNOESYスペクトルの詳細な解析から明らかにした。さらに、2つのステロイド環のピラジン環を介した結合様式は、¹⁵N-HMBCスペクトルにおいて1位プロトンとN2位窒素、および1’位プロトンとN3位窒素間にクロスピークが観測されたことから、X線結晶構造解析で構造が明らかにされたインド洋産半索動物Cephalodiscus gilchristi由来のcephalostatin 1 と同じことが判明した。

　Ritterazine B(2)はC₅₄H₇₈N₂O₉の分子式を持ち、各種NMRスペクトルを詳細に解析した結果、ritterazine Aと同様な構造をもつことが明らかとなった。2つのステロイド環のピラジン環を介した結合様式は、¹⁵N-HMBCスペクトルの測定とN-メチル誘導体のN-メチル基と1位および4’位との間のNOEから1と同じと結論した。ritterazine Cは2と同一の分子式を有し、類似したNMRスペクトルを与えることから、ritterazine Bの異性体で、末端の6員環スピロケタールが5員環スピロケタールに変化した構造をもつと決定した。さらにritterazine Cの絶対立体配置を新Mosher法を用いて決定した。なお2を重クロロホルム中に放置したところ、約50%がritterazine Cに変換したのでritterazine Bの絶対立体配置もritterazine Cと同一と結論できた。以下同様にして、ritterazine D-Zの構造を明らかにした。

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　主成分で最も強い細胞毒性(P388に対してIC₅₀＝0.15ng/mL)を持つritterazine B(2)を、LiAlH₄/AlCl₃で還元するとF’環が開環したセコ体が得られ、その活性は240ng/mL(IC₅₀)と約1/1000に低下した。一方、10%-HCl/MeOHで処理すると17’位の水酸基が脱水したシクロペンタジエン体が得られ、その活性は2300ng/mL(IC₅₀)と約1/10000に低下した。以上の結果より、ritterazine Bの活性には17’位の水酸基と左末端の5,6スピロケタールが最も重要であるとが考えられる。しかし、2の7’,17’-デヒドロキシル体であるritterazine YはIC₅₀＝3.5ng/mLの活性を示し、酸条件で処理した脱水生成物と比較すると17’位の水酸基の有無ではなく、シクロペンタジエン環形成に伴うコンフォメーションおよびフレキシビリィティの変化が重要な意味をもつものと推察された。

　以上、本論文は、伊豆半島産群体ホヤから、ritterazine A-Zと命名した強い細胞毒性を示すステロイドニ量体26種を単離・構造決定するとともに、構造-活性相関に検討を加え、海洋無脊椎動物の抗癌剤としての有用性を示すと同時に、抗癌剤開発にとっても重要な知見を与えたもので、学術上および応用上寄与するところが大きい。よって審査員一同は、本論文提出者に対して博士(農学)の学位を授与してしかるべきと判定した。