1993年熱海で採集した海綿D.kiiensisにP388マウス白血病細胞に対する顕著な細胞毒性が認められたので、活性成分の単離と構造決定を試みた。凍結海綿(5.0kg)をエタノールで抽出後、細胞毒性を指標に活性成分の分離・精製を試みた。すなわち、濃縮液を水とエーテル、次いで水とn-ブタノールで分配した。活性が認められたn-ブタノール層をODSフラッシュクロマトグラフィーおよびSephadex LH-20を用いるゲルろ過で分画後、最終的に逆相HPLCで精製してdiscodermin E-H(1-4)と命名した4種の活性成分を得た。

　Discodermin E(1)はFABMSにおいてm/z1709に(M+H)⁺イオンピークを与え、¹Hおよび¹³CNMRスペクトルからペプチドと推定された。そこで、アミノ酸分析および2次元NMRより構成アミノ酸を調べたところ、各1モルのAsn、Ala、Leu、Pro、Phe、Arg、Cys(O₃H)および2モルのThrに加え、異常アミノ酸t-Leu2モル、MeGln、Sarおよびkynurenine(Kyn)各1モルを含むことがわかった。まず、NMRによる各アミノ酸の同定を次のようにして行った。すなわち、DMSO-d₆中で測定したDQF-COSYおよびHOHAHAスペクトルからアミノ酸残基内のスピン系の解析を行い、また、側鎖に4級炭素を含むt-LeuおよびMeGlnとSarのN-メチル基はNOESYとHMBCにより帰属した。さらに、MeGlnとAsnの側鎖のアミドプロトンは、カルボニル炭素が結合したメチレンプロトンとのNOESYクロスピークによって確かめ、異常アミノ酸のKynの存在は二次元NMRおよび標品との¹³CNMRデータの比較により決定した。これらのアミノ酸配列はアミドプロトンと隣接アミノ酸のプロトンあるいはアミドプロトンとのNOESYスペクトルのクロスピークによって決定した。ところで、discodermin Eはニンヒドリン試薬に陰性で、N末端がブロックされている環状構造を持つものと予測された。事実、N末端アミノ酸のAla残基のアミドプロトンと160.3ppmの炭素の間にHMBCでクロスピークが観測されたので、discodermin EのN末端にホルミル基が結合していることが判明した。さらに、Thr(1)のプロトンとSarのカルボニル炭素間にHMBCクロスピークが認められることから、Thr(1)の水酸基がC末端のカルボニル基とエステル結合していると結論した。

　アミノ酸残基の絶対立体化学はdiscodermin Eの酸加水分解物をMarfey誘導体に導いた後、HPLC分析を行って決定した。また、discodermin Eを脱ホルミル化後、4回エドマン分解に付し得られたデカペプチトを酸加水分解後にMarfey誘導体に導きならびHPLC分析して、4番目と5番目のアミノ酸残基をそれぞれD-t-LeuおよびL-t-Leuと決定した。

　同様に解析して、discodermin F(2)は既知のdiscodermin AにおけるD-t-Leuの代りにD--MeIleが、discodermin G(3)はD-Alaの代りに-aminobutyric acid(Aba)が、さらにdiscodermin H(4)はL-Pheの代りにL-Tyrが置き換わった構造をもつことを明らかにした。なお、NOESY実験および脱ホルミル体のアミノ酸配列分析から、discodermin Aの構造は12番目と13番目のアミノ酸配列が逆の構造に訂正するであることを示すことができた。

　Discodermin E-HはP388マウス白血病細胞に対してそれぞれ0.02、0.1、0.4および0.1g/mLの濃度で細胞毒性を示した。

　次に、屋久島産H.cf.erectusの脂溶性画分に強い細胞毒性が認められたので、活性物質の単離・構造決定を試みた。凍結海綿(1.2kg)のエタノール抽出物を水とエーテルで二層分配した。活性が試められたエーテル層をKupchan法により溶媒分画して得られたCCl₄およびCH₂Cl₂層を、Sephadex LH-20を用いるゲルろ過で分離した。強い活性を示す画分からは、既知のaltohyrtin類が得られた。さらにゲルろ過でaltohyrtin類の後から溶出する活性画分を逆相HPLCで精製したところ、3種のscalarane型セスタテルペン5-7を単離した。

　5-7は¹H NMRのピークの重なりが激しいため、CDCl₃/CD₃OD(3:1)およびDMSO-d₆中で各種2次元NMRを測定し構造決定を試みた。化合物5の分子式は高分解能FABMSおよび¹³CNMRのデータからC₂₅H₃₈O₄と決定した。¹HNMRから5つのシングレットメチル,3つのオキシメチンおよび1つのオレフインプロトンの存在が示唆された。さらに、2次元NMRスペクトルより4環性炭素骨格が明らかとなった。また、COSYスペクトルで20位のプロトンは18位および16位のプロトンとのロングレンジカップリングを示し、さらに¹³C NMRとUV[217nm(7800)]データから、,-不飽和--ラクトンの存在が示唆された。また、20位のプロトンから18位と16位の炭素へHMBCクロスピーク認められることから、ラクトン還がD-環に結合していることが明らかになった。一方、DMSO-d₆中でのCOSYスペクトルから、12位と16位に水酸基が結合していることがわかった。

　化合物5の立体化学はプロトン間の結合定数値の解析とNOESY実験から明らかにした。16位と15位の結合定数が11Hzで、いずれもアキシアルであることがわかったので、5は16-epi-16-O-deacetylscalarolbutenolideである。

　化合物6の¹H NMRスペクトルは、2.10ppmにアセチルのメチルシグナルが存在し12位のプロトンが5に比べ1.38ppm低磁場シフトしていること以外は5のスペクトルと類似していた。また、FABMSから6の分子量は5より42だけ大きいことが示唆されたので、6は5の12位の水酸基がアセチル化された12-O-acetyl-16-epi-16-O-deacetylscalarolbutenolideと決定した。

　化合物7は6と同じ分子式を与えたが、¹H NMRデータが大きく異なることから別種の炭素骨格をもつことが示唆された。¹³C NMRデータを検討したところ、化合物7はscalarinのデータとC12およびC21を除いてよい一致を示すことがわかった。そこで各種二次元NMRデータに基づき構造研究を行ったところscalarinの12位のアセトキルシ基が欠落し、21位の炭素がアセトキシル化されていることが判明した。さらにNOESYデータの解析から、相対立体配置を決定した。化合物5-7は、P388細胞に対して0.4,2.1および0.9g/mLの濃度で細胞毒性を示した。

　1993年に馬毛島で採集した海綿Stelletta globostellata(Carter,1883)の脂溶性画分に強い細胞毒性が認められたので活性成分の単離および構造決定を試みた。凍結海綿(1.0kg)をエタノールで抽出後、n-ヘキサンと90%MeOHで二層分配を行った。さらに、90%MeOH画分をODSフラッシュクロマトグラフィー、Sephadex LH-20によるゲルろ過および逆相HPLCで精製して4つの活性成分、globostellatic acids A-D(8-11)を得た。

　化合物8の分子式をFABMSおよび¹³C NMRからC₃₂H₄₃O₇Naと決定した。¹H NMRから5つのシングレットメチル、2つのビニルメチルおよび5つのオレフィン水素の存在が認めされた。また、¹³CNMRおよびUVスペクトルデータからmalabaricaneあるいはisomalabaricane骨格をもつものと推定された。COSYおよびHMBCスペクトルより共役ポリエン鎖と3環性炭素骨格の存在が認められたので、さらに詳しく構造解析を行った。すなわち、3環性炭素骨格については、COSYから得られた3つの部分構造を3つのシンダレットメチルから観測されるHMBCクロスピークの情報に基づいて連結することができた。さらに、HMBCデータから24位のカルボキシル基は4位の炭素に、そして12位のケトンは11位の炭素に結合していることが明らかになった。一方、COSYおよびHMBCデータから側鎖にケトンと共役したポリエンが存在し、末端にジメチルカルビノール基が存在すること、ならびにそのケトンが4置換オレフインと結合することが示された。HMBCスペクトルより26位と28位のメチルプロトンからそれぞれ13位の炭素にクロスピークが認められたことから、側鎖と四置換二重結合の結合様式が明らかとなった。側鎖の二重結合の幾何異性は結合定数値およびNOESYデータから16E,18Eおよび20Eと決定した。また、26位と28位のメチル基の間にNOEが認められることから13位の二重結合はZ型と結論した。

　3環性部分の立体化学は、B環の¹³C NMRのケミカルシフト値とNOESYデータからisomalabaricane型であることがわかった。すなわち、B環中のメチン炭素のケミカルシフト値の文献値との比較および26位のメチルと5位および1位のプロトンの間ならびに27位のメチルと9位のプロトン間にNOESYスペクトルでクロスピークが認められたことから、トランスーシスートランス型の立体配置をとることがわかった。さらに24位のメチルと5位のプロトン間にNOESYでクロスピークが認められたこと、ならびに3位と2位のプロトン間のカップリング定数が小さいことから、A環部の立体化学が明らかとなった。同様に、化合物9-11について二次元NMRを中心に構造解析を行い、相対立体配置を含めた構造を決定することができた。

　化合物8-11はP388マウス白血病細胞に対し0.1,0.1,0.46および0.1g/mLの濃度で細胞毒性を示した。

　以上、新しい構造と作用機序をもつ抗腫瘍物質の探索と開発を目的とし研究を行った結果、日本沿岸産の海綿3種から、11種の新規細胞毒性物質を単離・構造決定することができ、海綿が医薬資源の探索源としで有望であることを示すことができた。

　熱海産海綿D.kiiensisにP388マウス白血病細胞に対する顕著な細胞毒性が認められたので、活性成分の単離と構造決定を試みた。凍結海綿をエタノールで抽出後、細胞毒性を指標にして各種クロマトグラフィーを用い、活性成分の分離・精製を試みた結果、discodermin E-Hと命名した4種の活性成分を得た。

　Discodermin E(1)はFABMSにおいてm/z1709に(M+H)⁺イオンピークを与え、¹Hおよび¹³C NMRスペクトルからペプチドと推定された。そこで、アミノ酸分析および2次元NMRより構成アミノ酸を調べたところ、各1モルのAsn、Ala、Leu、Pro、Phe、Arg、Cys(O₃H)および2モルのThrに加え、異常アミノ酸t-Leu2モル、MeGln、Sarおよびkynurenine(Kyn)各1モルを含むことがわかった。これらのアミノ酸の配列をNOESYスペクトルの解析によって決定した。なお、N末端にホルミル基が結合していること、およびThrの水酸基がC末端のカルボニル基とエステル結合していることは、HMBC実験によって決定した。

　アミノ酸残基の絶対立体化学は酸加水分解物をMarfey誘導体に導いた後、HPLC分析を行って決定した。また、脱ホルミル化と4回エドマン分解して得られたデカペプチドを同様に処理して、4番目と5番目のアミノ酸残基をそれぞれD-t-LeuおよびL-t-Leuと決定した。

　同様に解析して、discodermin F-Hは、2〜4の構造をもつことを明らかにした。なお、同時に既知のdiscoderminAの構造を、12番目と13番目のアミノ酸配列が逆であることを明らかにした。

　Discodermin E-HはP388マウス白血病細胞に対して、それぞれIC₅₀0.02、0.1、0.4よび0.1g/mLの細胞毒性を示した。

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　次に、屋久島産H.cf.erectusの脂溶性画分に強い活性が認められたので、活性物質の単離・構造決定を試みた。凍結海綿のエタノール抽出物を常法に従い分画したところ、5つの既知化合物に加え、3種の新規scalarane型セスタテルペン5-7を単離できた。

　化合物5は、分子式C₂₅H₃₈O₄をもち、¹H NMRから5つのシングレットメチル,3つのオキシメチンおよび1つのオレフィンプロトンの存在が示唆された。2次元NMR実験から、,-不飽和--ラクトンをもつscalarane型セスタテルペンの構造が示唆された。さらに、NOESY実験を含む詳細な2次元NMR解析により、5を16-epi-16-O-deacetylscalarolbutenolideであると決定した。同様に、6と7の構造を決定した。

　化合物5-7は、P388細胞に対してIC₅₀0.4,2.1および0.9g/mLの細胞毒性を示した。

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　最後に、強い細胞毒性が認められた馬毛島産S.globostellataから活性成分の単離および構造決定を試みた。凍結海綿をエタノールで抽出後、溶媒分画と各種クロマトグラフィーで精製して4つの活性成分、globostellatic acids A-Dを得た。

　Globostellatic acid A(8)、C₃₂H₄₃O₇Naは、各種NMRおよびUVスペクトルデータから新規isomalabaricane型トリテルペンと結論された。さらに、側鎖の二重結合の幾何異性および環部分の立体化学を、主にNOESYデータから、8のように決定した。同様に、globostellatic acids B-Dの構造を決定した。

　Globostellatic acids A-Dは、P388マウス白血病細胞に対しIC₅₀0.1〜0.46g/mLの細胞毒性を示した。

　以上、本論文は、新しい抗腫瘍物質の探索を目的に、顕著な細胞毒性が認められた3種の海綿から活性物質の検索を試み、20種の細胞毒性物質を単離するとともに、11種の新規化合物の化学構造を解明したもので、学術上、応用上寄与するところが大きい。よって審査員一同は、本論文提出者に対して博士(農学)の学位を授与してしかるべきと判定した。