放線菌は、抗生物質をはじめとする種々の二次代謝産物を生産することで知られるダラム陽性の細菌である。放線菌により生産される抗生物質は非常に種類が豊富で、既知の約9千種類の天然抗生物質のうちの約6割を生産することが知られている。また、放線菌は、固体培地上で胞子から基底菌糸として生育し、基底菌糸が気中菌糸へと分化し、その後気中菌糸の先端に連鎖状の胞子を形成するという複雑な生活環を持ち、形態分化という面においても興味深い微生物である。 Streptomyces griseusにおいては、放線菌における二大特徴である二次代謝(ストレプトマイシンおよび黄色素生産)と形態分化(気中菌糸への分化、それに続く胞子形成)が、A-ファクターと名付けられた低分子物質により誘導されており、A-ファクターによる複雑な調節ネットワークが提唱されている。本研究では、上流からのA-ファクターシグナルをストレプトマイシン生合成遺伝子クラスターに直接伝達するステップの解明を目的とし、まずはじめに、A-ファクターレセプターより下流でストレプトマイシン生合成遺伝子クラスターまでの経路における変異株を取得し、その性質を検討した。これと併行して、既に存在が明らがになっているストレプトマイシン生合成遺伝子クラスター内のstrR遺伝子の上流領域に結合するA-ファクター依存性たんぱく質の精製を行い、そのたんぱく質の機能解析を行った。 (1)変異株HO1の取得と変異の解析 A-ファクター合成遺伝子の欠失変異株S.griseus HH1は、ストレプトマイシン非生産、胞子形成不能という形質を示す。このHH1株の紫外線照射により形質の変化したものをスクリーニングしたところ、ストレプトマイシン生産能と胞子形成能を同時に回復する変異株を11株取得した。その内の形質の安定している5株について解析したところ、4株はA-ファクターレセプターを発現していなかった。残りの1株は、A-ファクター結合活性を保持していた。この変異株をHO1と名付けた。HO1株は、A-ファクター結合活性を保持していたので、A-ファクターレセプターの変異ではないと当初考えられたが、その後、当研究室でクローニングされたA-ファクターレセブター遺伝子(arpA)をHO1株に導入したところ、ストレプトマイシン非生産、胞子形成不能という形質を示した。このことから、HO1株の変異点はA-ファクターレセプター遺伝子内のA-ファクター結合ドメイン以外の部分にあり、A-ファクターレセプターの他の遺伝子へのリプレッサーの役割が果たせなくなった変異であることが推定された。したがって、ArpAのアミノ酸配列を考えあわせると、A-ファクターレセプターはC末側のA-ファクター結合ドメイン(センサードメイン)とN末側のDNA結合ドメイン(制御ドメイン)の二つの独立した機能ドメインから成り立っていることが示唆された。 (2)strRの上流転写調節領域内の97bp断片に結合するたんぱく質群 strR遺伝子は、ストレプトマイシン生合成遺伝子クラスター内のstrA,B1,G,F,H,I,K,S,T,stsCの転写を活性化する転写因子をコードしていて、クラスター内の発現調節のkeyの遺伝子であり、いわゆるpathway-specific transcriptional activatorである。この遺伝子はA-ファクター依存性プロモーター活性を持ち、その領域は転写開始点から-241〜-371bpであること、また、-188〜-285bpの97bpのDNA断片にAファクター依存性たんぱく質が結合することが分かっていた。この97bpのDNA断片をRI標識し、野生株S.griseus 13350とA-ファクター合成能欠失変異株HH1とについて、60%硫安沈澱後DEAEクロマトグラフィー(0〜1M KClグラジェント)を行い、ゲルシフト分析によりA-ファクター依存性たんぱく質の存在を確認した。 97bp内の様々な長さのDNA断片を合成し、これをRI標識した97bpと共に加えゲルシフト分析を行い、競合的にシフトバンドが消失することを指標に結合領域を狭めていったところ、A-ファクター依存性たんぱく質は-256〜-285bpの30bp内に結合し、どちらの端においてもこれより3bp欠けると結合しなくなることが分かった。さらに、DNaseIフットプリントによりDNA上の結合領域を確認したところ、Coding鎖においては-246〜-279b、Non-coding鎖においては-252〜-285bという上記の30bpを含む40bpに結合していた。 これとは別に、A-ファクターには依存しないものの97bp領域の-189〜-241bpおよび-241〜-285bpに結合する2種類のDNA結合たんぱく質も同定したが、これらの機能については、今後の課題である。  図表(3)A-ファクター依存性たんぱく質の精製 野生株S.griseus13350 30L培養を集菌し、マントンゴウリンにて細胞を破砕し、遠心上清を40%硫安沈澱した。遠心分離後上清をプチルカラム(40〜0%硫安)にかけ、次にヘパリン・アフィニティーカラム(0〜1M KCl)、次にFPLC・DEAEカラム(0〜1M KCl)にかけた後、結合領域30bpを含む35bpをタンデムに連結したものを結合させたDNAアフィニティービーズにより、最終的にSDS-PAGE上で40kDa付近に近接した二本のバンドを得た。 今回精製したたんぱく質は、A-ファクター調節ネットワークの中で、上流からのA-ファクターシグナルを直接受容するstrRプロモーターの塩基配列(レシーバー)に伝達する役割を有している。今後、本たんぱく質のアミノ酸配列決定および遺伝子のクローニングにより、このステップの詳細が明らかになると期待される。また、このたんぱく質をコードする遺伝子はA-ファクターに応答するはずであり、その発現調節を検討することによってネットワーク中の上流の制御ステップも明らかにできると考えられる。  図表 |