泌乳は乳腺において最終的な分化機能の過程で起こる現像であり、プロラクチンはミルクの合成に密接に関係する。プロラクチンが作用するには乳腺細胞膜に存在するレセプターに結合しなければならない。プロラクンチンは、乳腺においてプロラクチンレセプターに結合して標的細胞の機能を調節する。泌乳中においてはミルクの合成を調節する。乳腺のプロラクチンレセプター数は泌乳の開始時から増加し泌乳の末期に向かって徐々に減少する。 乳腺を含め多くの器官で分子量の異なる2種類のプロラクチンレセプターが存在する。プロラクチンレセプターmRNAにおいても長さの異なる2種類が同定され、ロングとショートに区別されている。この違いは遺伝子からの転写後におこるRNAのプロセッシングの過程で生じることが明らかにされた。近年、乳腺では特にロングタイプのプロラクチンレセプターがミルク合成に深く関与することが解明され、事実、乳腺で主要なものとなっている。肝臓等に多く含まれるショートタイプの役割、機能とも不明である。泌乳中の動物に吸乳や搾乳を中止すると泌乳が停止し、乳腺の退行が始まる。この過程におけるプロラクチンレセプターとそのmRNAの消長は明らかではない。又、泌乳を再開した時の消長も不明である。 本研究では、プロラクチンレセプターと泌乳能力との関係を明らかにする目的で泌乳の停止及び再開過程におけるプロラクチンレセプターとそのmRNAの消長を調べた。最初にプロラクチンレセプターmRNAを測定する方法を確立した。次に泌乳時期の異なる乳腺でmRNAレベルの変化を調べた。しかし、mRNAのレベルは合成と分解の速度のバランスで決定される。分解する速度の推定は離乳により、また、合成速度の推定は再噛乳することによって行った。 泌乳ICRマウスを用いた。分娩した日を泌乳0日とし、子供の数を10匹に合わせた。泌乳1、5、10、15日に子供を親から隔離した(離乳0時)。再哺乳は離乳24時に里子を同居させることにより行った。ミルク合成の有無はカゼインmRNAの測定により行った。プロラクチンレセプターは標識プロラクチンを用いたレセプターアッセーを行い、スカッチャードの方法で解析し、レセプター数と解離係数を求めた。グアニジンチオシアネート法を用いてRNAを抽出した。ランダムプライマーと逆転写酵素を用いてcDNAを合成した。cDNAを含んだ反応液にコンペティターDNAを加え、PCRを行った。PCRに用いたコンペティターDNAは、プロラクチンレセプターとカゼイン(分子量22k)の2種類、プライマーはプロラクチンレセプターのロングとショート用の2組、カゼイン用の1組を用いた。コンペティターDNAの量を連続的に変化させ、競合的PCRによるmRNAの定量を行った。1.5mg chlorpromazineと0.1mgCB-154を腹腔内に投与し、6時間後で実験に使用した。離乳6時間に1IU oxytocinを腹腔内に投与し離乳9時間で実験に使用した。血清中の乳糖の定量は血清に等量の10%TCAを加えて除タンパクを行い、Chloroformで処理して抽出液とした。乳糖を -galactosidaseでglucoseとgalactoseに分解し、glucose oxidase法で測定した。組織学的検索では乳腺をブアンで固定し、通常の方法でパラフィン切片とした。ヘマトキシリンーエオジンで染色した後、ルーメンの面積を画像処理装置で計測した。 泌乳5日のマウス乳腺細胞は、約2千個のプロラクチンレセプターを持っているが、離乳1日で70%減少し、細胞当たり600個となった。その後,続いて離乳すると少しずつ減少した。一方、再哺乳した群では元のレベルに回復した。生理的食塩水(対照群)、1.5mg chlorpromazine、0.1mg CB-154投与し、6時間後にレセプター数の変化を調べた。対照群と比べてchlorpromazine投与した群は54%減少し、CB-154投与した群は69%増加した。離乳開始供にCB-154投与し、1日後のプロラクチンレセプター数の変化は1日離乳したものと同じレベルであった。離乳によるプロラクチンレセプター数の減少は内在性プロラクチンの影響でなく、実際にプロラクチンレセプター数が減少したことを示している。解離係数変化しなかった。 泌乳5日のマウスを用いて離乳によりプロラクチンレセプターmRNAの分解と再哺乳により合成を調べた。ロングタイプのmRNAのレベルは離乳6時間まで一定したが、6時間から12時間に大きく減少し、2/5の濃度となった。18時で約70%と最低になった。以後、離乳を続けると徐々に増加した。1日離乳により減少したロングタイプmRNAのレベルは再哺乳6時間後に元のレベルまで増加し、以後時間の経過と共に徐々に減少した。 -カゼインmRNAは、離乳1日で90%以下減少し、再哺乳によりmRNAは増加した。本研究から、プロラクチンレセプターののmRNAの分解速度及び合成速度を推定するには24時間の離乳及び6時間の再哺乳が適当であると判断した。 プロラクチンレセプターmRNAレベルの変化の要因としてミルク存在の有無が考えられた。このため次の実験を行った。0、0.1、1IUのoxytocinを離乳6時に投与し、3時間後で測定した。投与量に対応してロングタイプのプロラクチンレセプターmRNAレベルは低下した。oxytocin投与のレプセターmRNAの減少に相応するカゼインmRNAの変動は見られなかった。ミルクの再吸収は,血液中の乳糖の濃度により調べた.離乳18時で乳糖の濃度が急激に増加した。過度のミルク貯留は12から18時間の間でおこっていることが分かった。オキシトシン投与により同様な現像を起こすことが出来る。オキシトシン投与した群においても用量依存的にプロラクチンレセプターmRNAの減少が認められた。離乳1日後、2-3日齢の子供4または8匹を、9-11日齢の子供4または8匹を里子とし6時間再哺乳させ、吸乳刺激の程度によるプロラチンレセプターとカゼインmRNAの変化を調べた。4匹の2-3日齢の里子をの群ではロングタイプレセプターmRNAレベルが他の群より2/5以下のレベルを示した。カゼインmRNAレベルはレセプターmRNAレベルとほぼ平行して変化した。又、5日齢の4匹里子で再哺乳させ、ミルクを貯留している乳腺とミルクがない乳腺でレセプターmRNAレベルを調べた。ミルクが吸乳された乳腺で約2.5倍高かった。吸乳刺激の弱い群でプロラクチンレセプターmRNAの増加が少なかった。以上の結果からミルクの貯留の有無がレセプター遺伝子発現と関係することを明らかにした。 泌乳初期から末期までのプロラクチンレセプターmRNAレベルの変化は泌乳1日に高く得られた。以後、一定した割合を持って徐々に減少した。変化したプロラクチンレセプターmRNAはロングタイプに対応したので,ショートタイプに対応したレセプターmRNAレベルは低く、変動も余り見られなかった。カゼインmRNAレベルは大きな変動が認められず、徐々に増加し、泌乳10日に最高になってその以後低下した。泌乳1、5、10、15日に子供を親から隔離した。また。離乳24時に各々の泌乳日に相応しい里子10匹に合わせ、6時間の再哺乳を行った。離乳によりプロラクチンレセプターmRNAレベルは低下し、再哺乳を行うと6時間で急激に増加した。カゼインmRNAはレセプターmRNAに相応する変化を示した。泌乳15日のマウスでは再哺乳によりレプセターmRNAレベルが増加し、離乳を行うとレセプターmRNAが少しずつ増加した。プロラクチンレセプター数が急激する時期(泌乳5日目)以降の乳腺でmRNAレベルの減少が大きく、また、増加の程度も大きかった。この時期最も活発に遺伝子発現が起こっていることを明らかにした。 乳腺に存在するプロラクチンレセプターmRNAは大部分ロングタイプである。本研究のより乳腺プロラクチンレセプターは遺伝子発現の段階で調節され、特に泌乳中ではミルク貯留の有無により大きく影響を受けることを明らかにした。又、プロラクチンレセプター数とレセプターmRNAレベルとは必ずしも対応していない。その原因として遺伝子レベルでは活発に発現しているが、分解も活発であり、従ってmRNAレベルが低いという結果であった。本研究により、mRNAレベルを生理機能との関係で研究する実験においてはmRNAの合成と分解の各程度を考慮する必要があることを明らかにした。 |