サイトカインは、免疫・造血系や神経系をはじめとする哺乳動物のさまざまな機能系における重要な調節因子である。現在までに、20種類以上におよぶ多様なサイトカインとそれぞれに特異的な受容体からなるシステムが、生体の発生、恒常性の維持における巧妙なな調節機構を担っていることが多くの例において明らかにされてきた。顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は未分化な造血系細胞の増殖、生存、分化を支持するサイトカインであり、同時に、分化した好中球、単球、マクロファージなどにおける機能発現にも重要な役割を果たす。高親和性GM-CSF受容体は、GM-CSFに特異的な鎖と、IL-3,IL-5,GM-CSFの受容体に共通の鎖の2つのサブユニットから構成される。これらおよび他のサイトカイン受容体を構成する蛋白質は、細胞外領域にいくつかの共通した構造した構造、1)WSXWSモチーフ、2)通常4つの、ほぼ等間隔で並んだCystein残基、3)通常2つの、約100アミノ酸からなり特徴的な2次構造を持つドメイン(フィブロネクチンのタイプIIIドメインに類似しているため、Fn3ドメインと呼ぶ)がある。申請者は、ヒトGM-CSF受容体鎖の染色体遺伝子の単離、構造の決定と、組織における発現の検討を行った。またこの遺伝子を含めすべてのサイトカイン受容体遺伝子のエクソン・イントロン構造を、蛋白質の構造と対比させながら比較することにより、サイトカイン受容体遺伝子ファミリーの進化に関する考察を行った。

　ヒトGM-CSF受容体鎖遺伝子はX,Y両染色体の偽常染色体領域に存在する。これを利用して、XまたはY染色体に特異的なゲノムDNAライブラリーをスクリーニングし、全長をカバーするcontigを得、その制限酵素地図を作成した。遺伝子の全長は約45kbであり、13のエクソンからなっていた。ゲノムDNAを用いたSouthern解析の結果は、スクリーニングで得られたクローンの制限酵素地図とほぼ一致した。さらに、この遺伝子について以下の点を明らかにした。

　成熟した哺乳動物の脳を構成する細胞のほとんどは、胎児の脳の脳室周辺に存在する神経上皮細胞が増殖、分化を行うことによって生じる。主要な細胞系列としてニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトがあるが、さらに、分化した各系列の細胞は著しい多様性を示す。とりわけニューロンは、細胞の形態、神経伝達物質の種類、他の細胞との結合様式などの異なる細胞群が、集団として機能的な神経回路網を形成することによって、知覚や学習、記憶といった脳の高次機能を実現している。しかし、脳の発生過程のどの段階で、またいかなる分子機構によって、神経系細胞の多様化が決定されるのかについては、現在のところ未知の点が多い。この問題に取り組む手がかりとして、申請者は胎児脳の特定の領域においてのみ発現する転写調節因子に着目した。これら領域特異的遺伝子の多くは、胎児脳の神経上皮組織の特定の領域だけでなく、そこから発生したと考えられる分化したニューロンにも引き続き発現しているため、神経系細胞の多様化の決定において何らかの機能を果たしている可能性がある。そこで申請者は、胎生11.5日ラットの前脳、中脳の神経上皮細胞から樹立された複数の不死化細胞株を用いて、前脳あるいは中脳領域における領域特異的遺伝子の発現を解析した。

　c-mycとエストロゲン受容体のリガンド結合領域の融合遺伝子がコードする蛋白質、MycERは、培養液中のエストロゲンの存在に依存して線維芽細胞を形質転換することが知られている。この融合遺伝子を持つ組み替えレトロウィルスを用いて初代培養の神経上皮細胞を不死化して得られた約40の細胞株(MNS細胞株、Nakafuku and Nakamura(1995)Joumal of Neuroscience Research,4,153-168)のうち、5株について解析を行つた。まずこれらに共通の性質として、未分化神経上皮細胞のマーカーであるnestin,vimentin,RC1抗原の発現、生体内における神経上皮細胞の増殖因子とされるbFGF,EGFに対する増殖応答性、細胞の凝集塊の形成を促進する培養条件下でのニューロンおよびグリアへの分化能を見いだした。このことから、解析した5種類のMNS細胞株はいずれも、未分化神経上皮細胞の性質を有していると考えられた。次に、定量RT-PCR法により、各細胞株における領域特異的遺伝子の発現を検討した。胎児の前脳領域で領域特異的に発現している転写因子であるPax-3,Pax-5,Pax-6,Dlx-1,Dlx-2,Dbx,Otx1,Emx2などの発現パターンは細胞株により大きく異なっていた。一方、En-1,Hox-B.1,Hox-B.3など、中脳あるいはそれよりも後方においてのみ発現している遺伝子はいずれの細胞株にも発現していなかった。さらに各細胞株に分化を誘導すると、未分化状態で発現していた遺伝子の発現はさらに増大するかあるいは少なくとも同程度のレベルに維持されており、未分化状態で発現していなかった遺伝子の発現が誘導されることはなかった。次に、背腹軸の決定に重要な役割を果たす誘導シグナルであるSonic hedgehog(SHH)に対するMNS細胞の反応を検討した。この分泌性因子は、中枢神経系の前後軸の全長にわたって、腹側の神経上皮細胞あるいはニューロンに特異的に発現するIsl-1,Nkx-2.1,Nkx-2.2などの遺伝子を誘導するが、どの遺伝子が誘導されるかはは、標的組織の前後軸上の位置によって異なる。申請者は、SHHを過剰発現するCV1細胞株の培養上清の添加、あるいはMNS細胞とこの細胞株との共培養を行い、異なる細胞株がSHHに対して、上記の腹側特異的遺伝子の誘導という点において異なる応答性を有することを見いだした。

　以上の解析で用いた試験管内細胞培養系においては、由来を異にする細胞からの誘導シグナルが存在しない条件で領域特異的遺伝子の発現を解析することができるが、各MNS細胞株は、増殖や分化を行っても特定の組み合わせの領域特異的遺伝子の発現を維持していた。同様の結果は、不死化細胞株でなく神経上皮由来の初代培養細胞を用いた場合でも得られた。以上の結果より、神経上皮細胞は、部位特異的遺伝子の選択的な発現を維持する何らかの機構を、細胞内在的に保持していることが示唆される。さらに、SHHに対する応答性の検討結果より、このような細胞内在的機構は同時に、細胞外シグナルに対する神経上皮細胞の応答性をも規定していると考えられる。したがって、胎児脳の神経上皮組織においては、細胞内在的な機構と外的な因子の両者が、領域特異的な遺伝子発現の制御を行っており、この状況がMNS細胞株において再現されているのではないかと推察される。今後は、このような単純なモデル系を用いて、神経上皮細胞の領域特異性の決定の分子機構をさらに明らかにしていきたいと考えている。