導入:細胞内カルシウム濃度の変化は、種々の生理現象の発現に重要な役割を果たしていると考えられている。イノシトール3リン酸(IP₃)は細胞外からのホルモン等の刺激に応じて細胞内に産生されるセカンドメッセンジャーのひとつであり、イノシトール3リン酸受容体(IP₃R)は、このIP₃により細胞内カルシウム貯蔵部(小胞体)からカルシウムを放出するチャネルである。IP₃Rとして、今までに、異なる遺伝子にコードされ、相互に相同性の高い、タイプ1、2、3という分子がクローニングされている。(以下、それぞれをIP₃R1、IP₃R2、IP₃R3、と略記する。)IP₃Rはリン酸化酵素や、アデノシン三リン酸など、多くの分子から機能調節を受けていると考えられており、細胞内カルシウム濃度調節のひとつの要となっている。

　カルモジュリン(CaM)は代表的なカルシウム結合蛋白質であり、カルシウム濃度の上昇により構造変化して多くの酵素等に結合し、活性を調節することが知られている。CaMは、広い動物種で広い組織分布を持って存在しており、マウスではほとんどの臓器で数M以上の高濃度で存在している。

　細胞膜透過処理した肝上皮由来細胞を用いた実験で、IP₃によるカルシウム放出が、各種CaM阻害剤(W7、W13、CGS9343B)により抑制されることが、1988年にHillらにより報告されたが、この系でのCaMの標的分子は不明である。

　一方、小脳から精製したIP₃R(主としてIP₃R1)がCaM-Sepharoseに結合することは既に報告されていたが、その後の解析は進んでいなかった。

　IP₃Rに対するCaMの作用として、ひとつは細胞内カルシウム濃度によるIP₃Rのカルシウム放出活性の調節を仲介している可能性が考えられる。小脳由来の膜画分や膜透過処理した細胞を用いた実験ではカルシウム濃度0.2-0.3MでIP₃によるカルシウム放出活性が最大となるという調節が知られている。この調節は、細胞内カルシウム濃度を適度に変動させるために大変重要なものと考えられているうえ、近年では、カルシウムオシレーションやカルシウム波の発生機序とも深く関わるものとして注目されてきている。現在まで、精製したIP₃Rではこの調節は検討されておらず、IP₃Rへのカルシウムの作用は、CaMを介している可能性がある。そこで、私はCaMがIP₃Rに直接作用する可能性を追究するため、IP₃R1上のCaM結合領域の同定や、結合の解離定数の測定をはじめとした研究を行った。

　方法と結果:一般に、CaMは、標的分子中の20-30アミノ酸からなる二次構造を認識して結合する。そこで、私は、以下のように、IP₃R1のCaM結合に必須なアミノ酸領域を決定した。1.マウスIP₃R1のcDNA全長を培養細胞で発現させ、このIP₃R1がCaMに結合することを確かめた。2.そのcDNAに制限酵素を用いて各種の部分欠失を導入して、発現させ、欠失によりCaM結合能が失われる部分を調べた。3.2.の結果から結合に必須と考えられた部分を、融合蛋白質として大腸菌で発現させ、CaM結合能を確認した。4.3.で用いた部分のcDNAを両側から削っていき、それを発現させて結合能を調べ、CaM結合能が失われない最小範囲、IP₃R1,Lys1564-Arg1585を結合領域とした。この領域は、他のCaM結合蛋白質のCaM結合領域と同様に複数の塩基性アミノ酸を含む両親媒性-ヘリックス構造を取り得る。なお、CaM結合能は、CaM-Sepharoseカラムへのカルシウム依存性結合を指標とした。

　このCaM結合領域中には、Trp残基が存在している(Trp1576)が、Trp残基は多くのCaM結合タンパク質において、結合に必須であることが示されている。そこで、Trp1576をAlaに置換したIP₃R1cDNAを、クンケル法により作製し、その、変異IP₃R1の全長を培養細胞で発現させ、CaM結合能をみた結果、結合能が失われていた。これにより、Trp1576がIP₃R1のCaM結合に必須であり、このTrpを含む領域がIP₃R1の中で唯一のCaM結合領域であることが示された。

　次に、結合領域(Lys1564-Arg1585)に相当するペプチドを合成し、CaMとの解離定数を以下のように測定した。アミノ酸置換の実験において、Trp1576がIP₃R1のCaM結合に必須であることが示されたので、このペプチドのTrp残基が持つ蛍光は、CaMと結合した状態では変化することが予想された。実際に測定したTrp残基の蛍光は、ペプチド溶液中のCaM濃度を上昇させるにつれて、短い最大蛍光波長と高い蛍光強度をもつスペクトルに変化する事が確認できた。この変化を利用してペプチドとCaMの解離定数を求めたところ、カルシウム存在下では、0.7M、非存在下では、0.1mM以上と求められた。

　一方、IP₃R1のCaM結合領域をもとに、他のタイプのIP₃RのCaM結合能についても以下のように明らかにした。IP₃R2分子中の、IP₃R1のCaM結合領域に相当する位置のアミノ酸配列(Lys1565-Arg1587)は、IP₃R1と相同性が高いことから、IP₃R2でもこの領域がCaM結合能を有すると予想された。そこで、この領域を含むIP₃R2の一部、Gln1558-Ala1596をコードするcDNAをPCR法によりクローニングし、融合蛋白質として大腸菌で発現させたところ、この融合蛋白質はCaM結合能を示した。一方、IP₃R3では全長にわたって、IP₃R1のCaM結合領域との有意な相同性はみられない。そこで、IP₃R3のcDNA全長を培養細胞に発現させて調べた結果、IP₃R3はCaM結合能を持たないことが明らかになった。

　次に、IP₃R1のCaM結合領域に相当するペプチドを、ウサギに免疫して抗血清を得た。この抗血清のIgG画分は、イムノブロットにより小脳膜画分中IP₃Rと特異的に反応することが確認された。さらに、このIgG画分は小脳IP₃R1のCaM結合を阻害した。そこで、CaM結合によるIP₃Rの機能調節の可能性を探るため、小脳膜画分からのIP₃誘導カルシウム放出へのこの抗体の効果を見たところ、阻害効果が見られた。

　考察:本研究からは、まず、CaM結合領域の位置に関する情報が得られた。IP₃R1には、cAMP依存性リン酸化酵素(PKA)によりリン酸化される部位が二箇所知られており、CaM結合領域(Lys1564-Arg1585)の近傍にそのうちの一つがある(Ser1588)。PKAによるリン酸化は、肝細胞など多くの系で、IP₃によるカルシウム動態に影響することがわかっている。一方、いくつかののCaM結合タンパク質において、CaM結合とその近傍のアミノ酸のPKAによるリン酸化は、互いに抑制するなどの相互作用が存在することが知られている。IP₃R1においても同様の相互作用の可能性が考えられる。

　また、本研究を通して、IP₃Rの3つのタイプ間でのCaM結合の差が明らかになった。IP₃R1、IP₃R2の間では、分子全体の中でほぼ同じ位置にCaM結合能をもつ構造が保存されている一方、IP₃R3は、相当する位置が全く異なった一次構造になっており、全長でもCaM結合能を持たない。また、IP₃R1では、CaM結合領域のごく近傍にPKAによるリン酸化部位が存在している一方、IP₃R2では、その部位に相当する付近のアミノ酸配列は、全く保存されておらず、リン酸化され得ない。これらのことは、IP₃RがCaMとリン酸化によりタイプごとに違った調節を受けている可能性を示唆している。IP₃Rの各タイプでは調節機構等の差異が今までほとんど明らかになっておらず、CaM結合やリン酸化部位の差は、各タイプの生理的機能の分担を考える際に重要な示唆を与えるものである。IP₃によるカルシウム放出に関しては、実験に用いる細胞や組織の種類によって、カルシウムやPKAによる異なった調節機構があることが示唆されてきており、IP₃Rのタイプ間での差が、この多様性を生み出すひとつの要素として働きうる。

　本研究中、IP₃R1上のCaM結合領域とCaMとの解離定数が求められたので、それをもとにIP₃R1とCaMが細胞内で結合している可能性を推測できる。小脳ではCaMの濃度が高く、可溶性画分中の小脳平均でのCaM濃度が約19M(19mole/litre of tissue)であるとの報告がある。さらに、IP₃R1もCaMも、ともにプルキンエ細胞に局在しシナプス後膜近くの滑面小胞体様構造に多く存在することも免疫電顕や生化学的分画などで調べられている。小脳プルキンエ細胞内では、神経伝達に伴いカルシウム濃度が上昇するので、その際CaMは、0.7Mという解離定数から考えて、IP₃R1に結合して何らかの作用を及ぼしていると考えられる。

　また、IP₃R1のCaM結合領域に対する抗体によって、IP₃誘導カルシウム放出が阻害されることが、本研究により示されたことから、CaMがIP₃Rに直接、結合することで、カルシウム放出活性という機能を調節をしている可能性が示唆された。

　本研究は、細胞内カルシウム濃度の調節において重要な役割を果たしていると考えられているイノシトール3リン酸受容体(IP₃R)の、カルシウム濃度依存的な機能調節機構の解明を目的とし、カルシウム結合蛋白質であるカルモジュリン(CaM)のIP₃R上の結合領域の同定をはじめとする、下記の結果を得ている。

　1. タイプ1 IP₃R(IP₃R1)のcDNAに各種の部分欠失を導入して発現させ、CaM結合能をみることにより、IP₃R1のCaM結合に必要な範囲として、アミノ酸配列Lys1564-Arg1585を同定し、CaM結合領域とした。

　2. この領域中(Lys1564-Arg1585)に存在しているTrp残基が、IP₃R1のCaM結合に必須であり、このTrpを含む領域がIP₃R1の中で唯一のCaM結合領域であることを、Trp1576をAlaに置換したIP₃R1 cDNAを作製して培養細胞で発現させ、結合能の消失をみることにより示した。

　3. この領域(Lys1564-Arg1585)に相当するペプチドを合成し、共存するCaMの濃度変化にともなう、ペプチド中のTrp残基の蛍光変化を測定することにより、このペプチドとCaMとの解離定数を、カルシウム存在下では、0.7M、非存在下では、0.1mM以上と求めた。これにより、実際に生体内でカルシウム濃度が上昇する際、CaMは、IP₃R1に結合して何らかの作用を及ぼしていると考えられた。

　4. タイプ2 IP₃Rの分子中、タイプ1 IP₃RのCaM結合領域に相当する位置の、Gln1558-Ala1596はCaM結合能を示すことを、この部分をコードするcDNAを発現させて明らかにした。一方、タイプ3 IP₃RのcDNA全長を培養細胞に発現させ、タイプ3 IP₃RはCaM結合能を持たないことを示した。タイプ1 IP₃Rでは、CaM結合領域のごく近傍にPKAによるリン酸化部位が存在している一方、タイプ2 IP₃Rでは、その部位に相当する付近のアミノ酸配列は、全く保存されておらず、リン酸化され得ない。これらにより、IP₃RがCaMとリン酸化によりタイプごとに違った調節を受けている可能性が示唆された。

　5. さらに、IP₃R1のCaM結合領域に相当するペプチドに対するウサギ抗血清を得、そのIgG画分が小脳IP₃R1のCaM結合を阻害することを示した。また、このIgG画分が小脳膜画分からのIP₃誘導カルシウム放出を阻害することを示し、CaMがIP₃Rに直接結合することで、カルシウム放出活性という機能を調節している可能性を示唆した。

　以上、本論文はCaMのIP₃Rへの結合領域の同定を通して、CaMがIP₃Rに直接、結合することで機能を調節している可能性を示唆した。本研究は、カルシウム濃度の変化に伴うIP₃Rの機能調節機構の解明に重要な貢献をなすと考えられ、学位の授与に値するものと考えられる。