上記の変異lck遺伝子に遠位プロモーターを連結して構築した遺伝子を、C57BL/6マウスに導入し、Tgマウスを作製した。導入遺伝子の有無は、ジェノミックサザンブロットハイブリダイゼーション解析によって判定した。作製したTgマウス胸線細胞の解析はフローサイトメトリー(FACS)を用いて行った。また、p56^lckのキナーゼ活性はin vitroキナーゼアッセイで測定した。

　細胞内に存在するp56^lckのうち、CD4あるいは、CD8に会合するp56^lckのチロシンキナーゼ活性について、抗CD4抗体、抗CD8抗体などを用いた免疫沈降とin vitroキナーゼアッセイで解析した。キナーゼ反応は氷上で5分、および15分間で測定した。キナーゼ反応物は10%SDSポリアクリルアミド電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーによって、[-³²P]ATPを反応産物に取り込んだバンドを検出した。

　von Boehmerらによって作製された、H-Y Tgマウスは、雌C57BL/6マウスから単離したCD4-CD8⁺キラーT細胞クローン由来の雄抗原(H-Y)特異的クラスI(H-2D^b)MHC拘束性TCR遺伝子を導入したマウスである。このH-Y Tgマウスは大部分のT細胞でTg TCRを発現するようになる。このTCR発現T細胞はH-2^bの遺伝的背景のもとで雌においてはポジティブセレクションを受け、雄においてはH-Y抗原とTCRが反応しネガティブセレクションを受ける。よって、H-Y Tgマウス雌の胸腺細胞では、ポジティブセレクションの結果、CD8SP細胞群の比率が増加している。H-Y Tgマウスの雄の胸腺細胞では、DPに分化する段階でネガティブセレクションがおこり、DP細胞群もCD8SP細胞群も極端に減少している像が見られる。このH-Y TgマウスとDLGKR Tgマウスを交配し、そのF₁マウスを得て、抗CD4、抗CD8抗体で染色しFACSでCD4/CD8プロファイルを解析した。

　CBA/Jマウスは特定の内因性スーパー抗原を発現し、それと反応する特定の(5、11、6など)陽性細胞は、胸腺内でネガティブセレクションをおこし、成熟胸線細胞や末梢T細胞中にほとんど存在しない。CBA/JマウスとDLGKRマウスを交配させ、F₁の胸腺細胞を抗CD4、抗CD8抗体、抗抗体で3カラーFACS解析を行い、胸腺細胞全体に占める、CD4SP細胞あるいはCD8SP細胞のうちの、特定のをもつT細胞の比率を算出し、ネガティブセレクションの起こり方を調べた。

　コントロールマウス、Tgヘテロ、ホモのマウスの胸腺細胞のCD4/CD8パターンを比較すると、導入遺伝子のコピー数に比例してCD4SP細胞群の比率が減少していた。成熟T細胞のマーカーとなるTCR、またセレクションをうける細胞に特異的に発現する早期活性化マーカーCD69の発現を比較すると、コントロールマウスよりヘテロTgマウス、ヘテロTgマウスより、ホモTgマウスのほうが、TCR^highの細胞についてもCD69⁺の細胞についても減少が認められた。未熟細胞のマーカーであるheat stable antigen(HSA)、成熟細胞のマーカーであるMHC classI分子の一つQa-2の発現パターンから、導入遺伝子の頻度が高いほどSP細胞中でも最も成熟度の高いHSA-Qa-2⁺細胞群の比率が減少していた。さらに、抗TCR抗体でコントロール、Tg各マウスの胸腺細胞を刺激し、CD69の発現上昇を検討したところ、コントロールマウスでは抗TCR抗体の濃度依存的にCD69の発現が上昇したのに対し、Tgマウスでは導入遺伝子のコピー数に比例して発現上昇度も抑制されていた。

　コントロールマウス、DLGKR Tgマウスの胸腺細胞を用いたin vitroキナーゼアッセイの結果から、CD4分子あるいはCD8分子と会合しているp56^lckのキナーゼ活性は、DLGKR Tgマウスではコントロールのマウスに比べて約1/3であった。DLGKRマウスの胸腺細胞では抗CD4(IgM)抗体を用いて、CD4分子を5分、10分、架橋刺激した場合においても、p56^lckのキナーゼ活性の上昇は認められなかった。T細胞内に発現し、やはりsrcファミリーのチロシンキナーゼp59^fynのキナーゼ活性を比較するとコントロールマウスでもDLGKR Tgマウスでも胸腺細胞でのp59^fynのキナーゼ活性には差異はなかった。

　H-Y TgマウスとDLGKR Tgマウスの交配で得られた雌F₁マウスの胸腺細胞のCD4/CD8プロファイルをコントロールと比較した。DP細胞群の比率に変化がなかったのに対し、CD8SP細胞群での著しい減少が確認された。即ち、"dead p56^lck"発現DLGKR TgマウスにおいてDP細胞からCD8SP細胞への分化、すなわちポジティブセレクションが抑制されていることが示された。

　H-Y Tgマウスの雄の胸腺細胞では、DN細胞からDP細胞へ分化する段階でネガティブセレクションをうけるため、DP細胞群やCD8SP細胞群の比率も極端に減少している。ネガティブセレクションが抑制されるならば、DP細胞の産生量が回復すると予想されるが、DLGKR Tgマウスとの交配で得られた雄のF₁マウスの胸腺細胞のCD4/CD8プロファイルでは、DP細胞群の比率もCD8SP細胞群の比率もコントロールと比較しても有意な増減は認められなかった。即ち、dead p56^lckを発現するH-Y Tgマウスにおいてネガティブセレクションは抑制されないことが示唆された。

◆内在性スーパー抗原による特定の TCR⁺細胞のネガティブセレクションは"dead p56^lck"によって抑制されない

　CBA/Jマウスでは、6、11、5を鎖に持つT細胞が、内在するスーパー抗原と反応してネガティブセレクションを受け、その結果6、11、5陽性T細胞の比率が減少している。8.2⁺T細胞は、ネガティブセレクションを受けないので、コントロールとして用いた。DLGKRマウスとCBA/Jマウスの交配で得られたF₁マウスの胸腺細胞のCD4SP細胞、CD8SP細胞での6、11や5の使用頻度には注目すべき変化は観察されなかった。8.2⁺T細胞群の比率にも変化は認められなかった。つまり、内在性スーパー抗原による6、11、5のネガティブセレクションは"dead p56^lck"によって抑制されないことが示唆された。

　ポジティブセレクションとネガティブセレクションが誘導される際の、細胞内シグナル伝達系の違いについては、これまでほとんど解明されていなかった。1995年になって、1)カルシニューリンの活性化がポジティブセレクションには必要であるが、ネガティブセレクションには必要でない、2)p21^ras-raf-MAPKK-MAPKのシグナル伝達系のp21^rasやMAPKKのドミナントネガティブマウスではポジティブセレクションはブロックされるがネガティブセレクションはブロックされない、という報告がなされた。本研究では、新たにp56^lckのチロシンキナーゼ活性の必要性に違いがあることが明らかになった。