第1章ではマウス長幹骨より分離した破骨細胞、およびin vitroの破骨細胞形成系において形成された破骨細胞様細胞におけるc-Srcの発現を検討した。破骨細胞形成系としては、高橋らによって開発されたマウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養系を用いた(Takahashi et al.Endocrinology 123:2600,1988)。この共存培養系では、活性型ビタミンD3の存在下で4日目より破骨細胞様多核細胞(OCL)の形成が始まり、6日目にピークを迎え、その後減少する。特異的な抗体によるWestem blottingで調べた。共存培養におけるc-Srcの発現の変化は、OCL数の時間的な変化と全く一致した。次に骨芽細胞、共存培養細胞、赤津らの方法でenrichしたOCL画分(Akatsu et al.,J Bone Miner Res 7:1297,1992)におけるc-Srcの活性を、外来の基質であるenolaseを用いたimmune complex kinase assayで調べた。その結果、OCLを含む割合が高い画分ほどc-Srcの活性が高いことがわかった。さらに免疫染色を用いてマウス長幹骨より得た破骨細胞、およびOCLにおけるc-Srcの発現を調べたところ、破骨細胞のみならず、OCLにおいても強いc-Srcの染色像が認められた。以上の結果より、破骨細胞においてc-Srcが強く発現していることが明らかになった。破骨細胞におけるc-Srcの機能を調べるための第一段階として、c-Srcの破骨細胞内での局在を電子顕微鏡的に検討した。破骨細胞において、c-Srcは主に酸、酵素を分泌する波状縁に局在し、骨への接着部位である明帯、あるいは波状縁の対側である外側基底膜にはほとんど認められなかった。この結果はc-Srcが破骨細胞の酸、酵素の分泌、あるいは波状縁の形成自体に重要な役割を果たしていることを示唆する。

　破骨細胞におけるc-Srcの役割をさらに詳細に検討するためには、c-Srcのシグナルを受け取る二次メッセンジャーを同定することが重要である。第2章では、最近Srcのターゲットとして注目されているFocal Adhesion Kinase(FAK)に注目し、FAKの骨吸収における役割を検討した。まずSrcチロシンキナーゼ阻害剤の破骨細胞の骨吸収に対する効果を調べた。破骨細胞の骨吸収のモデルとして、OCLによるdentine上での吸収窩の形成系を利用した(Tamura et al.,J Bone Miner Res 8:953,1993)。Herbimycin Aやmethyl 2,5-dihydroxycinnamateなどのチロシンキナーゼ阻害剤は、OCLによるdentine上での吸収窩の形成を用量依存性に抑制した。それと同時に、OCLのF-actinリングの形成も阻害された。この時、破骨細胞内のチロシンリン酸化蛋白の変化を、抗ホスホチロシン抗体を用いたWestem blottingで調べた。破骨細胞においてチロシンリン酸化されている主要な蛋白は115kDから130kDの分子量を示し、これらの蛋白のチロシンリン酸化はHerbimycin Aによって抑制されることが明らかになった。特異的な抗体を用いた免疫沈降、及び抗ホスホチロシン抗体を用いたWestem blottingにより、この蛋白の少なくとも一部はFAKであることを確認した。FAKはv-Srcで癌化した細胞において強くチロシンリン酸化されている蛋白の1つとして、Parsonsらのグループによって同定された(Schaller et al.,Proc Natl Acad Sci USA 89:5192,1992)。その後、正常細胞においても細胞の基質蛋白の認識、接着に伴ってFAKはチロシンリン酸化され、focal adhesionに集積することが明らかにされ、インテグリンを介したシグナル伝達分子の1つであることが明らかになった。FAKは細胞内で接着刺激に伴いチロシンリン酸化されるが、この時のリン酸化部位はSrcのSH2ドメインに結合しうることが明らかにされている。OCLのcell lysateから特異的な抗体(Dr.Parsonsより供与された)を用いてFAKを免疫沈降し、抗ホスホチロシン抗体によるウエスタンブロットによってFAKのチロシンリン酸化を調べると、FAKは接着した破骨細胞において定常的にチロシンリン酸化されていることが明らかになった。また、ハービマイシンAで細胞を処理することによってそのチロシンリン酸化は抑制された。次に破骨細胞におけるFAKの局在を調べるために、抗FAK抗体を用いた免疫染色をおこなった。プレートに接着した状態では、FAKは破骨細胞の細胞膜近傍に局在することが明らかになった。Herbimycin Aの処理により、FAKは細胞の中心部に存在する空胞様の膜構造へと移行した。破骨細胞の骨吸収におけるFAKの働きをさらに明らかにするために、FAKのアンチセンスDNAのOCLの吸収窩形成能に対する効果を調べた。アンチセンスDNAは、マウスFAKのcDNAのATGイニシエーションコドンを含むようにデザインし、ホスホロチオエートによって修飾したものを用いた。FAKに対するアンチセンスDNAは破骨細胞様細胞による吸収窩形成を阻害したが、センスDNAには抑制効果は認められなかった。またアンチセンスDNAと等量のセンスDNAをあらかじめ混合して加えた場合には、吸収窩形成の抑制効果は認められなかった。FAK cDNAの2つの異なる部位に対するアンチセンス、センスDNAを用いて実験をおこなったが同様の結果であった。これら結果は、少なくともFAKの存在が破骨細胞による骨吸収に重要な役割を果たしていることを示唆する。

　以上の諸成績より次の事項を結論することが出来た。破骨細胞のみならず共存培養系で形成された破骨細胞様細胞においてc-Srcの強い発現が認められた。破骨細胞内では、特に酸、酵素の分泌部である波状縁にc-Srcの強い集積が認められた。Focal Adhesion Kinaseは、破骨細胞におけるc-Srcのシグナルを伝える分子の一つとして骨吸収に重要な役割を果たしていることが判明した。