電位依存性Ca²⁺チャネルは多くの興奮性、非興奮性細胞に見出されているが、神経細胞には特に多種類のCa²⁺チャネルが共存しており、その電気生理学的、薬理学的性質によりT、L、N、P、Q、Rの各タイプに分類されている。成体において、異なるタイプのCa²⁺チャネルはその相対的発現量や細胞内分布が神経細胞の種類によって大きく異なっており、それぞれ伝導、シナプス伝達、シナプス可塑性などに重要な生理的役割を果たしていると考えられている。一方、発生初期の神経細胞では、電位依存性Ca²⁺チャネルが膜の興奮性の主体を成し、細胞死あるいは神経突起の形態分化などの神経回路の形成過程に関与していると考えられている。しかし、各タイプCa²⁺チャネルの発現量や特徴的な細胞内分布を、どのような生体内因子が制御しているかに関しては殆ど報告がない。以上より、私はラット胎仔海馬神経細胞を用い「Ca²⁺チャネルの発達を制御している因子の同定、およびその生理的意義の解明」を目的として研究を行い、basic fibroblast growth factor(bFGF)を初めいくつかのサイトカインにCa²⁺チャネルの発達を制御する作用があることを見出した。bFGFによりその発達を制御されるCa²⁺チャネルの特性、作用発現までの細胞内情報伝達機構、細胞内分布の特性を中心に検討した。

　第2章より本研究で用いた培養海馬神経細胞では、high K⁺誘発[Ca²⁺]i上昇に対する細胞内Ca²⁺ストアの寄与は殆どないことが示された。また第3章のwhole cell patch-clamp法による結果ともよい対応が観察されたことから、第2章で用いた実験系はCa²⁺チャネル応答を評価する簡便なスクリーニング系となることが示唆された。そこで第2章と同様の実験系を用いて、先ず各種サイトカインのCa²⁺チャネル応答に対する影響を検討した。その結果、interleukin-2(IL-2)、neurotrophin-3(NT-3)、activinにbFGFと同様のCa²⁺チャネル応答の増大作用があることを見出した。Nerve growth factor(NGF)、brain-derived neurotrophic factor(BDNF)、epidermal growth factor(EGF)はCa²⁺チャネル応答に影響を与えなかった。次に、bFGFによるhigh K⁺誘発[Ca²⁺]i上昇増大作用の発現に関与している細胞内情報伝達系について薬理学的検討を加えた。bFGF(10ng/ml)の作用はチロシンキナーゼ阻害剤のgenistein(10M)により抑制された。また、Rasを介する情報伝達系を阻害するN-Acetyl-S-farnesyl-L-cysteine(20M)によっても抑制された。他の情報伝達系を阻害するU-73122(1M)、wortmannin(100nM)、Li⁺(3mM)あるいはrapamycin(1M)の共添加では抑制されなかった。更にbFGFの作用はforskolin(100M)、または8-Br-cAMP(1M)の共添加によって抑制された(図4)。PKC阻害剤のcalphostin CはbFGFの作用に影響を与えず、アラキドン酸(1M)、PMA(100nM)単独適用ではhigh K⁺誘発[Ca²⁺]i上昇応答は影響を受けなかった。bFGFは多くの細胞内情報伝達系を活性化することが知られているが、本章の結果からbFGFが受容体チロシンキナーゼを活性化した後、Ras、Rafの活性化を介して[Ca²⁺]i上昇応答の増大作用を発現していることが示唆された。今後、bFGF以外の[Ca²⁺]i上昇応答の増大作用が見出されたサイトカインについて作用発現に関与する細胞内情報伝達系を解析することにより、神経細胞におけるCa²⁺チャネル発現制御機構の解明に重要な知見が得られるものと期待される。

　第2、3章の結果からbFGFによりLタイプCa²⁺チャネルの発現が増大している可能性が示唆された。そこで、LタイプCa²⁺チャネルの特異的蛍光プローブである(―)-STBodipy-DHPにより、bFGF(10ng/ml)で処理した海馬神経細胞における、LタイプCa²⁺チャネルの発現量の変化と細胞内の局在を共焦点レーザー顕微鏡を用いて検討した。対照群、bFGF群ともに細胞体の神経突起起始部に強い蛍光が局在して観察され、bFGF群では対照群と比較してその蛍光強度が有意に増大していた(図5左)。同一細胞におけるhigh K⁺誘発[Ca²⁺]i上昇応答がbFGF群において増大していた(図5右)ことから、bFGFによるhigh K⁺誘発[Ca²⁺]i上昇応答の増大は細胞膜上のLタイプCa²⁺チャネル量の増加に起因することが示唆された。更に、神経突起部での発現を検討したところ、bFGF群では神経突起の分岐点に強い蛍光のclusterが観察され、以前より当教室で報告してきたbFGFの強力な神経突起分岐形成能との関連が推察された。

　第5章の結果から、bFGFの分岐形成促進作用とLタイプCa²⁺チャネルの関連が推察された。そこでLタイプCa²⁺チャネルの阻害剤であるnicardipineのbFGF分岐形成促進作用への影響を検討した。5 M の nicardipineの共添加によって、bFGFの分岐形成促進作用は完全に抑制された(図6)ことから、bFGFによる分岐形成促進機構にLタイプCa²⁺チャネルが関与していることが示唆された。

図表図4 bFGFのhigh K⁺誘発[Ca²⁺]上昇応答増大作用に対するforskolin、8-Br-cAMPの抑制作用 / 図5 Lタイプ電位依存性Ca²⁺チャネルの発現量に対するbFGFの影響 / 図6 bFGFの神経突起分岐形成促進作用に対するnicardipineの影響

　本研究の結果、bFGFが培養海馬神経細胞に対して、LタイプCa²⁺チャネルの細胞体における発現量を増大させ、Ca²⁺チャネル応答の発達を促進することが明らかになった。また、その作用発現にはチロシンキナーゼ、Ras、Rafを介した細胞内情報伝達系が関与していることが示された。更に、bFGFがLタイプCa²⁺チャネルの神経突起分岐点への特徴的な局在化をもたらすことにより、神経突起の分岐形成を促進している可能性が示唆された。IL-2、NT-3、activinにもCa²⁺チャネル応答の発達促進作用を見出されたことから、神経細胞におけるCa²⁺チャネルの発達が多様なサイトカインによって制御されている可能性が示唆された。

　本研究の結果は神経細胞におけるCa²⁺チャネル発現制御機構の解明に重要な手がかりを与えるとともに、発達期におけるCa²⁺チャネルの生理的役割について重要な知見を与えるものと考えられた。