ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3-キナーゼ)はホスファチジルイノシトール(PI)の3位の水酸基をリン酸化する酵素であり、細胞の増殖や分化を制御する重要な情報因子である。この酵素は調節サブユニットであるp85と、触媒サブユニットであるp110から成るヘテロダイマーである。PI3-キナーゼは元来増殖因子受容体や癌遺伝子産物といった活性化したチロシンキナーゼと会合する脂質キナーゼとして同定された。活性化したチロシンキナーゼは細胞内基質のYXXM配列中のチロシン残基をリン酸化し、リン酸化されたこの部位にp85のsrchomology region 2(SH2)領域が特異的に結合する。PI3-キナーゼにYXXM配列を含むリン酸化ペプチドを添加するとPI3-キナーゼの活性が上昇することが報告されていることもあり、PI3-キナーゼの活性化はリン酸化チロシンがp85のSH2領域に結合することによってなされるという説が支配的である。一方最近、白血球中の走化性因子(fMLP)受容体等のGタンパク質共役型の受容体の活性化により、PI3-キナーゼの細胞内生成物であるPI(3,4,5)P₃の産生が認められている。ヒト白血球中に、p85-p110ヘテロダイマーと異なりGタンパク質のサブユニットによって活性化されるPI3-キナーゼが存在することを示唆する知見が相次いで出される中、今年ついにそのようなPI3-キナーゼの一つであるp110がクローニングされた。これらの知見よりfMLPによるPI(3,4,5)P₃の産生はGタンパク質のサブユニットによって活性化される(p85-p110ヘテロダイマーとは異なる)PI3-キナーゼによるといわれている。

　タチナタマメ由来のレクチンであるコンカナバリンA(Con A)は、マイトジェン作用を始めとする高い生物活性を持ち、食細胞を強く活性化するので炎症部位における細胞応答に良いモデルを提供する試薬である。Con Aは4価のレクチンで-D-マンノースと-D-グルコースに特異的に結合し、細胞表面の糖タンパク質を架橋することによって様々な細胞応答を引き起こすとされている。

　今回私はCon AがPI3-キナーゼの活性化に関わる2つの因子であるチロシンキナーゼとGタンパク質の両方を活性化することに着目し、食細胞をCon Aによって刺激した際のPI3-キナーゼの活性化機構と、PI3-キナーゼが食細胞の生体防御反応に貢献している可能性について検討した。

結果と考察1)Con A刺激によるタンパク質のチロシンリン酸化

　細胞をCon Aで刺激すると様々なタンパク質のチロシンリン酸化が15秒以内に観察され、1分で最大になりその後速やかに減弱していった。チロシンリン酸化される115Kと95Kのタンパク質の中には、それぞれ癌原遺伝子産物のCbl(図1D,E)とVavが含まれることがわかった。タンパク質のチロシンリン酸化は、PT前処理によってもワートマニン前処理によっても影響を受けなかった。

2)Con A刺激時のPI3-キナーゼの活性化

　PI3-キナーゼはリン酸化チロシンによって活性化するといわれているので、抗ホスホチロシン抗体(PY20)免疫沈降画分中のPI3-キナーゼの活性を測定した。Con A刺激によってPY20免疫沈降画分中のPI3-キナーゼ活性が増大し(図1C)、タンパク質のチロシンリン酸化と同様な経時変化を示した。刺激時にPY20免疫沈降画分中のPI3-キナーゼのp85サブユニットが増大することはWestern blotingで確認した(図1B)。またCon A刺激時には抗Cbl抗体免疫沈降画分中にもPY20免疫沈降画分と同程度のPI3-キナーゼ活性が認められた(図1G)。またCon Aによってチロシンリン酸化されたCblとp85が会合することはWestern blotingによって確認しており(図1F)、刺激時にPI3-キナーゼと会合するチロシンリン酸化タンパク質のほとんどはCblであると考えられた。VavはCblと同様にチロシンリン酸化されるが、Con A刺激時に抗Vav抗体免疫沈降画分中にPI3-キナーゼ活性は存在しなかった。Vavは低分子量Gタンパク質であるRasのGDP/GTP交換因子であるので、Con AによるVavのチロシンリン酸化はRasへのシグナルを仲介しているのかもしれない。

図1 Con A刺激によるCblのチロシンリン酸化とPI3-キナーゼとの会合

　続いてPI3-キナーゼによる細胞内生成物であるPI(3,4,5)P₃の産生を測定した。すると経時変化、Con A濃度依存性、及びPT感受性においてPY20免疫沈降画分中のPI3-キナーゼ活性の増加とは異なる性質を示した(表1)。Con A刺激によるPI(3,4,5)P₃の産生にはリン酸化チロシンに結合するp85-p110ヘテロダイマー型のPI3-キナーゼの活性の寄与は少なく、代わってGiを介したシグナルが活性化するPI3-キナーゼが関与していることが示唆された。一方この細胞をインスリンで刺激してもPY20免疫沈降画分中のPI3-キナーゼ活性が増大し、PI(3,4,5)P₃の産生が起こるが、どちらも同様のEC50値を示し、PT前処理によって影響を受けなかった。すなわちこの細胞内ではGiを介さないでPI(3,4,5)P₃を産生させる経路も存在すると考えられた。

表1 Con A刺激によるPI(3,4,5)P₃産生とPY20免疫沈降画分中のPI3-キナーゼ活性の増大の相違点3)活性酸素(O₂^-)の産生

　Con A刺激に対する細胞の最終応答としてO₂^-の産生を測定した。Con A刺激に対するO₂^-産生はCon Aの濃度依存的に増大し、細胞をワートマニンで前処理することによってワートマニン濃度依存的に抑制された。またPT前処理によっても強く抑制された。Con Aやワートマニンに対する濃度依存性がPI(3,4,5)P₃産生と極めて類似していることやPI(3,4,5)P₃産生と同様にPT前処理によって強く抑制されることからCon AによるO₂^-の産生にはPI(3,4,5)P₃産生が関与していると考えられる(図2)。Con A刺激によるO₂^-の産生は刺激時に-D-メチルマンノースや-D-フェニルマンノース、fMLPのアンタゴニストであるt-Boc-MLPを添加することによって強く抑制された。したがってこのO₂^-の産生は確かにレクチン作用によって引き起こされたものであり、少なくともその一部はfMLP受容体を架橋することによって引き起こされることが示唆された。

図2 Con A刺激によるPIP₃産生とO₂^-産生

　ホスファチジルイノシトール(PI)3-キナーゼはイノシトール環の3位水酸基をリン酸化する酵素で、細胞内では主にPI-4,5-P₂を基質としてPI-3,4,5-P₃(PIP₃)を産生する。本酵素はチロシンキナーゼ型受容体と会合することより、細胞増殖への関与が重要視されてきたが、近年好中球や血小板等の末梢細胞における細胞機能への役割も注目されており、食細胞では走化性因子による活性酸素(O₂^-)の産生やFc受容体を介した貪食などへの関与が指摘されている。一方、種々の生理活性作用をもつコンカナバリンA(Con A)は、4価のレクチンで-D-マンノースと-D-グルコースに特異的に結合し、細胞表面の糖蛋白質を架橋することによって様々な細胞応答を惹起すると考えられている。Con AはチロシンキナーゼとG蛋白質の両方の経路を活性化する試薬として、PI3-キナーゼの活性化機構を解析するにあたって有用なツールであると考えられた。「コンカナバリンAによる食細胞の活性化におけるイノシトールリン脂質3-キナーゼの関与」と題する本論文では、単球系のTHP-1細胞をCon Aで刺激した際のPI3-キナーゼの活性化機構を解析し、食細胞におけるO₂の産生機構の解明が試みられている。

　Con A刺激とFc受容体IIの架橋刺激によるCblのチロシンリン酸化とPI3-キナーゼとの会合

　THP-1細胞をCon Aで刺激すると、刺激後約1分をピークに多くの蛋白質のチロシンリン酸化が観察されたが、この中には癌原遺伝子産物であるCblとRasのGTP/GDP交換因子であるVavが存在した。さらに、Con A刺激時にCblとPI3-キナーゼの会合が認められたが、VavとPI3-キナーゼとの会合は観察されなかった。Cblのチロシンリン酸化及びPI3-キナーゼとの会合は、G蛋白質(G_i)とPI3-キナーゼのそれぞれの阻害薬である百日咳毒素とwortmanninによっては抑制されなかった。一方、免疫グロブリンIgGのFc部分を認識し貪食作用を担うFc受容体のFcRIIを架橋刺激した際にも、Cblのチロシンリン酸化とPI3-キナーゼとの会合が観察された。